Дифференцируя функциональной роли экспрессии генов от иммунной и не-иммунных клеток в мышь колит трансплантацией костного мозга

Общая цель эксперимента, показанного в этом видео, состоит в том, чтобы оценить, играет ли антимикробный пептид лиин роль в улучшении колита, вызванного сульфатом декстрана, у мышей. Это достигается путем введения костного мозга мышей дикого типа облученным мышам дикого и нокаутного типа и костного мозга нокаутных мышей облученным мышам дикого типа. Трансплантированный костный мозг будет генерировать новые клетки крови у реципиента донорского генотипа.

Затем мышей-реципиентов подвергают воздействию сульфата декстрана, чтобы вызвать колит через четыре недели. Успешная трансплантация подтверждается проточной цитометрией, а повреждение тканей толстой кишки оценивается с помощью гистологии. Получены результаты, которые показывают, что колит улучшается при трансплантации костного мозга дикого типа нокаутирующим мышам.

И наоборот, колит усугубляется при трансплантации нокаутирующего костного мозга мышам дикого типа. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в определении экспрессии генов из клеток, полученных из костного мозга или не полученных из костного мозга, при воспалении или инфекции. Для этого эксперимента рекомендуется использовать мышей C 57, черную шестерку, дикий тип и нокаутных мышей, чтобы можно было отслеживать мышей дикого типа и нокаутных мышей.

Донорские клетки после трансплантации костного мозга. Используйте мыши CD 45.1 для изображения мышей дикого типа и CD 45.2 для мышей с нокаутом. Приведенная здесь диаграмма описывает экспериментальную установку: для каждой группы назначены пять мышей-доноров и 10 мышей-реципиентов.

Для групп А и В костный мозг будет пересажен от мышей дикого типа мышам с нокаутом. Колит будет индуцирован в группе А, но не в группе В. Для групп С и D. Костный мозг будет пересажен от нокаутных мышей к дикому типу, а колит будет индуцирован в группе С только для Е и F. Трансплантация будет осуществляться от дикого типа к дикому типу и для групп G и H. Трансплантация будет проходить от нокаута к нокауту. Чтобы подготовить донорский костный мозг к передаче облученным мышам, начните с извлечения костного мозга из костей умерщвленных мышей в шкафу биобезопасности.

Используйте стерильные инструменты для рассечения, чтобы обнажить плечевую, бедренную, большеберцовую и малоберцовые кости, свободные от прикрепленных мышц и связок, и перенести их в чашку Петри. Разрежьте оба конца костей, чтобы показать красный костный мозг. Затем захватываем одну из костей щипцами.

Промойте красный костный мозг холодным PBS с помощью трехмиллилитрового шприца и игл 25 калибра в другую чашку Петри. Затем промойте кость с другого конца, чтобы получить больше клеток костного мозга. Повторите этот процесс с каждой из костей.

Объедините костный мозг дикого типа и выбейте мышей отдельно. Используйте шестимиллилитровый шприц с иглой 18 калибра в полдюйма, чтобы разорвать пробки красного костного мозга путем повторной аспирации и выброса. Затем с помощью серологической пипетки переложите собранный костный мозг в коническую трубку объемом 50 миллилитров

После того, как весь костный мозг будет переведен, вращайте костный мозг при температуре 740 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После вращения выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в течение 5-10 секунд. К грануле добавьте пять миллилитров одного буфера для лизиса XRBC на донорский вихрь мыши еще раз на пять секунд и инкубируйте ровно три минуты при комнатной температуре.

Через три минуты добавьте по 20 миллилитров холодного PBS в каждую пробирку и перемешайте путем инверсии, чтобы остановить лизис. Затем вылейте содержимое через ситечко 40 микрон в новую коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Промойте исходную пробирку пятью миллилитрами PBS и переложите раствор в сетчатое фильтр.

Продолжая собирать поток через коническую трубку. Затем доведите объем до 50 миллилитров с помощью PBS и перемешайте методом инверсии. Затем определите количество жизнеспособных клеток путем исключения трианового синего с помощью гемоцитометра.

После того, как количество клеток будет определено, вращайте клетки костного мозга в 913 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После вращения удалите надосадочную жидкость в зависимости от общего количества клеток. Резус суспендируют гранулу в PBS в разе от 10 до восьмой клетки на миллилитр.

Теперь клетки костного мозга готовы к переносу облученным мышам-реципиентам. Мышей-реципиентов дикого типа и нокаутных мышей для этого эксперимента облучали 1000 рад, как описано в сопроводительном документе, мышей разводили и размещали в помещении, свободном от патогенов, через 4-24 часа после того, как облучение согрело мышей-реципиентов на грелке под согревающей лампой для введения донорского костного мозга. Поместите мышь-реципиента в удерживающее устройство, протрите хвост 70% этанолом, чтобы стерилизовать место инъекции и стимулировать местную вазодилатацию для облегчения инъекции.

Используя инсулиновый шприц с иглой 28 с половиной калибра, введите по одному раз от 10 до седьмой клетки в количестве от одного до 200 микролитров в хвостовую вену каждой мыши после инъекции. Поместите мышь в клетку с тремя другими мышами, которым была введена инъекция, в течение первых четырех недель после инъекции. Мышей-реципиентов содержат в автоклавных клетках с водой, содержащей антибиотик сульфаниламидной обрезки.

Это дает животным время для восстановления иммунитета, смены клеток, обработанной антибиотиками воды и корма каждые четыре дня для поддержания гигиены. Через четыре недели после облучения и трансплантации костного мозга перейдите на обычную воду без антибиотиков и сохраняйте мышей еще две недели, чтобы восстановить нормальную микрофлору кишечника. Через шесть недель после инъекции костного мозга измерьте начальную массу тела, чтобы вызвать колит.

Мышам экспериментальной группы при колите дают 5%-ный сульфат декстрана в питьевой воде. Через пять дней соберите периферическую кровь четырех мышей в пробирки, покрытые гепарином, и поместите ее на лед. Затем в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра соедините 300 микролитров крови с 300 микролитрами окрашивания клеток, буферизуйте и аликвотируйте кровь в пять пробирок проточной цитометрии, помеченных от одного до пяти, каждая по 100 микролитров на льду.

После принесения мышей в жертву снова измерьте массу тела и рассчитайте изменение. Рассеките ткани толстой кишки и внесите в нее формалин для окрашивания h и d. Затем получить клетки костного мозга, как и раньше.

Разделите ресуспензионный костный мозг на пять микроцентрифужных пробирок, помеченных от одного до пяти, каждая по 100 миллилитров. При подготовке к анализу с помощью проточной цитометрии приготовьте смесь антител для каждой соответствующей пробирки в темноте, как описано в сопроводительном документе, образцы крови и костного мозга, помеченные номером один, будут служить контролем и не будут окрашенными образцами крови и костного мозга. Помеченный номер два будет окрашен подходящим контролем изотипа, контролем изотипа PE и раствором для блокировки CD 16 slash 32.

Эти контролеры изотипа используются для подтверждения специфичности образцов, связывающих первичные антитела. Помеченный номер три будет окрашен FZ CD 45.1 и CD 16 slash 32. Образцы блокирующего раствора, помеченные номером четыре, будут окрашены CD 45.2 и CD 16 slash 32.

Решение для блокировки. Одноцветное мечение может выявить присутствие донорских или реципиентных клеток в крови или костном мозге. Очевидно, что сэмплы, помеченные номером пять, будут окрашены для CD 45.1, CD 45.2 и CD 16 slash 32.

Блокируя здесь двойную цветовую маркировку, можно увидеть относительное соотношение донорских и реципиентных клеток в крови или костном мозге. Добавьте пять микролитров второй и пятой смеси антител в соответствующие пробирки с образцами. Затем добавьте три микролитра смеси антител три и четыре в соответствующие пробирки с образцами.

Инкубируйте все пробирки на льду в течение 30 минут. После инкубации добавьте в каждую пробирку по два миллилитра, по одному буферу для лизиса XRBC. Затем инкубируйте образцы еще 15 минут на льду в темноте.

Поверните ячейки вниз при 350 умноженных на G, пять минут при четырех градусах Цельсия. После отжима снимите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу с 500 микролитрами буфера для окрашивания клеток в темноте. Затем кратко вихрь.

Затем проведите проточную цитометрию на образцах крови и костного мозга для иммуноокрашивания. Выберите FZ, чтобы представить дикий тип CD 45.1, и PE, чтобы представить нокаут CD 45.2. Проанализируйте результаты проточной цитометрии с помощью программного обеспечения Flo Joe.

Рассчитайте отношение fit E к соотношению PE или отношение PE к fit e, чтобы определить, является ли генотип донора доминирующим генотипом в крови и костном мозге. На этом изображении представлены образцы изображений толстой кишки с нормальной гистологией и колитом DSS. Гистологические изображения оцениваются на основе повреждения тканей слизистой оболочки и инфильтрации нейтрофилов в слизистые и подслизистые оболочки

Таким образом, более высокая оценка гистологии указывает на более тяжелый колит, чтобы проверить, играет ли лиин роль в профилактике колита. Обмен костным мозгом осуществлялся между мышами дикого типа и нокаутами, как описано в этом видео. Затем гистология была оценена и оценена, как показано здесь.

Гистологические показатели были значительно увеличены при введении нокаутного костного мозга мышей дикого типа. И наоборот, баллы были значительно снижены, когда мышам с нокаутом вводили костный мозг дикого типа. Эти данные указывают на то, что эндогенный C из клеток, полученных из костного мозга, обладает противовоспалительным действием и улучшает состояние колита, что подтверждает успешность трансплантации у этих мышей.

Проточная цитометрия также проводилась на костном мозге и крови мышей после трансплантации. Костный мозг дикого типа сильно окрашивает при Фитце CD 45.1, но не при ПЭ, CD 45.2, как показано здесь, нокаутирующий костный мозг сильно окрашивает при ТЭЛА, но не при Фитце, как показано здесь. Однако после трансплантации костный мозг и кровь мышей дикого типа, получавших нокаутирующий костный мозг, сильно окрашивались на ТЭЛА, но не на Фитца, что указывает на то, что преобладающая популяция окрашенных клеток была от донора.

Аналогичным образом, костный мозг и кровь мышей с нокаутом, получавших костный мозг дикого типа, сильно окрашивались на фитзи, но не на ТЭЛА, что еще раз подтверждает, что преобладающие окрашенные популяции имели донорское происхождение. После просмотра этого видео вы сможете провести эксперимент по трансплантации костного мозга и сможете модифицировать колит с помощью клеток, полученных из костного мозга.