Изучение Протеолиз циклин B на одном уровне клеток в популяции клеток Всего

Целью данной процедуры является мониторинг того, как протеолиз циклина B регулирует начало анафазы и выход из митоза. Для этого сначала клетки с snap-репортером циклина B высевают на предметные стекла для микроскопии. На втором этапе химерная молекула snap-репортера циклина B маркируется флуоресцентным субстратом TMR star.

Затем на микроскопической станции проводится серия снимков. Заключительным этапом является анализ клеток и расчет интенсивности флуоресценции TMR star с течением времени, что отражает протеолиз белка cycling B. В конечном итоге иммунофлуоресцентная микроскопия живых репортерных клеток позволяет выявить кинетику протеолиза cycling B, происходящего во время митоза.

Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как мониторинг BGFP циклофилина B, является то, что использование SNAP-метки циклофилина B позволяет отслеживать деградацию самого циклофилина B, а не экспрессию белка в целом. Репортерные клетки со SNAP-меткой для данного эксперимента изначально выращивают асинхронно в логарифмической фазе в течение не менее 48 часов. Для начала проводят процедуру трипсинизации субконфлюэнтных репортерных клеток со SNAP-меткой для их посева в восьмилуночные микроскопические камеры, обеспечивая равномерное распределение клеток по всей поверхности камеры центрифуги.

Ресуспендируйте 10 000 клеток в 350 µL нормальной ростовой среды без фенолового красного. Перенесите клеточную суспензию в микроскопическую камеру для посева клеток в восьмилуночные микроскопические камеры с максимальной плотностью клеток в центре камеры. Сначала заполните камеру 300 µL нормальной ростовой среды без фенолового красного.

Затем осторожно добавьте 5 000 клеток в центр камеры микроскопа для посева клеток в специальные оптические 96-луночные планшеты с целью обеспечения равномерного распределения по всей поверхности лунки; центрифугируйте 5 000 клеток и ресуспендируйте их в 300 мкл нормальной ростовой среды без фенолового красного, исходя из общего количества необходимых лунок с клетками. Отрегулируйте количество клеток и общий объем суспендирующей среды.

Затем перенесите клеточную суспензию в 96-луночный планшет для высева клеток. Используйте специальные планшеты для оптики на 96 лунок, обеспечивая максимальную плотность клеток в центре лунки. Осторожно добавьте в центр каждой лунки по 1 500 клеток в 15 µL нормальной ростовой среды без фенолового красного в виде небольшой капли.

Это ограничит рост клеток центром лунки. Перед началом процедуры окрашивания, за 30 минут до нее, дайте всем высеянным клеткам расти в течение как минимум 18 часов в стандартных условиях культивирования клеток. Подогрейте порции нормальной ростовой среды без фенолового красного до 37 °C.

В качестве SNAP-субстрата в данной демонстрации используется TMR star для удобства работы. Растворите TMR star в DMSO для получения стокового раствора с концентрацией 400 µM. Разбавьте 0,5 µL стокового раствора TMR star в 200 µL подогретой нормальной ростовой среды без фенолового красного для получения конечной концентрации метки 1 µM. Затем удалите нормальную ростовую среду из асинхронно растущих клеток и замените её маркировочной средой. Инкубируйте клетки в маркировочной среде в течение 25 минут при стандартных условиях культивирования.

Через 25 минут удалите маркирующую среду и четыре раза промойте клетки теплой нормальной средой для роста без фенолового красного. После окончательного промывания инкубируйте клетки в 300 microliters теплой нормальной среды для роста без фенолового красного в течение 30 минут перед переносом под микроскоп. Замените среду свежей теплой нормальной средой для роста без фенолового красного, чтобы удалить остатки несвязанного субстрата snaps; переносите клетки к микроскопу в пенопластовом боксе на предварительно нагретом до 37 degree Celsius термоблоке.

За два часа до измерения интенсивности флуоресценции необходимо минимизировать температурные колебания. Установите температуру воздуха в климатической камере на 37 °C в режиме осушения, чтобы довести микроскоп и все его компоненты до требуемой температуры. Во избежание конденсации и последующего повреждения микроскопа важно выполнить предварительный нагрев перед установкой уровня влажности.

Когда вся система микроскопа достигнет 37 °C, установите влажность воздуха на уровне 60% и содержание углекислого газа на уровне 5%. Запустите программное обеспечение для сканирования или сбора данных и задайте стандартные настройки. Определите положения лунок, которые будут анализироваться. Задайте delta T или время цикла сбора данных, а также абсолютное количество циклов сбора данных.

В данной демонстрации для анализа большего количества лунок предварительно выбран аппаратный автофокус. Запустите процесс сбора данных и проконтролируйте первые два цикла сбора.

Микроскоп сфокусируется на сигнале GFP гистона H2 с последующим получением первого изображения в этом канале; затем фильтр будет заменен и будет получено соответствующее изображение TMR star. Эта процедура повторяется для всех позиций внутри лунки и для каждой из исследуемых лунок перед началом следующего цикла. Для анализа протеолитических профилей запустите программное обеспечение scan R analysis.

Проанализируйте изображения с ядрами клеток, визуализированными с помощью гистона H2 GFP, определив их как основные объекты с использованием порога на основе интенсивности сигнала и алгоритма водораздела для разделения соседних клеток. Для анализа TMR* следует создать субобъект, состоящий из ядра с цитоплазмой. Важными свойствами основного объекта являются координаты X и Y, время, максимальная и средняя интенсивность GFP для основного объекта, а также общая интенсивность, деленная на площадь.

Для суб-объекта TMR star переключитесь в режим трассировки, чтобы визуализировать среднюю интенсивность флуоресценции TMR star суб-объекта с течением времени или трассировки отдельных клеток, приписанных анализируемым основным объектам. Рассмотрение большего количества клеток позволяет получить первое репрезентативное и объективное представление, однако число исследуемых клеток можно сократить, используя гейтирование по тем измерениям, которые длятся не менее 140 циклов и имеют высокую максимальную интенсивность гистона H2 GFP. Выберите интересующую трассировку клетки, чтобы одновременно визуализировать флуоресценцию гистона H2 GFP и TMR star на уровне отдельной клетки.

С помощью правой кнопки мыши выберите интересующую клетку и создайте изображение для экспорта. Галерея для иллюстрации гистона H2 GFP и циклина B snap TMR star для каждой временной точки. Переключите программное обеспечение для анализа сканера в режим популяции и выделите область на точечной диаграмме (dot blot), где представлена интересующая клетка.

Примените новое окно точечного графика к выделенной области (гейту) и визуализируйте среднюю интенсивность флуоресценции TMR star с течением времени. Экспортируйте данные в Microsoft Excel для дальнейших расчетов. На представленных рисунках показана кинетика Cyclin B в виде кривой интенсивности флуоресценции TMR star клетки, проходящей через нормальный митоз без признаков неправильного расположения хромосом при уплотнении цитоплазмы после распада ядерной оболочки (NEBD), на что указывает красный треугольник; интенсивность флуоресценции TMR star резко возрастает до достижения изоморфного окна.

Когда клетка вступает в прометафазу, интенсивность флуоресценции остается на стабильном уровне, пока клетка проходит через профазу и метафазу, после чего начинает быстро снижаться. Как только все хромосомы формируют стабильную метафазную пластинку, это снижение предшествует расхождению хромосом. Во время анафазы, отмеченной синей точкой на кривой позднего митоза, хроматин начинает деконденсироваться, и клетка приобретает морфологию анафазы.

В то время как кривая интенсивности флуоресценции приближается к плато, которое оказывается ниже уровня плато, предшествовавшего митозу после его завершения. Этот метод открыл исследователям в области митоза путь к изучению строгого баланса между циклизацией, деградацией и синтезом, который регулирует протекание митоза.