Изучение Протеолиз циклин B на одном уровне клеток в популяции клеток Всего

Метафазы к анафазе переход срабатывает через анафазе способствующих комплекса (APC / C)-зависимых убиквитинирования и последующее уничтожение циклин B. Здесь мы создали систему, которая после импульсно-погоня маркировки, позволяет контролировать протеолиза циклин B во всей популяции клеток и облегчает обнаружение вмешательства митотической контрольно-пропускном пункте.

Целью этой процедуры является наблюдение за тем, как протеолиз цикличности В управляет началом анафазы и митотическим выходом. Это достигается путем первого засеивания циклических ячеек B snap на предметных стеклах микроскопии. Вторым шагом является маркировка химерной молекулы репортера циклина B с помощью флуоресцентного субстрата TMR-звезды.

Затем серия изображений собирается на станции микроскопии. Последним шагом является анализ клеток и расчет интенсивности флуоресценции звезды TMR с течением времени, которая отражает циклический протеолиз B. В конечном счете, иммунофлуоресцентная микроскопия живых репортерных клеток раскрывает кинетику циклического протеолиза В, происходящего во время митоза.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как мониторинг циклона BGFP, заключается в том, что циклон B SNAP позволяет контролировать деградацию циклона B, а не экспрессию цельного белка. Репортерные клетки Snap для этого эксперимента первоначально могут расти асинхронно в логарифмической фазе в течение как минимум 48 часов. Начнем с того, что процедура посева трипсина представляет собой субслияние репортерных ячеек для засеивания клеток на восьмилуночные камеры микроскопа при постоянном распределении по всей поверхности камерной центрифуги.

10 000 клеток и Resus расходуют в 350 микролитрах фенолового красного свободного нормального питательного вещества. Перенесите клеточную суспензию в камеру микроскопа для затравки клеток на восемь луночных камер микроскопа с максимальной плотностью клеток в центре камеры. Сначала загрузите в камеру 300 микролитров фено-красной свободной нормальной питательной среды.

Далее аккуратно прибавляем 5 000 клеток к центру камеры микроскопа для засеивания клеток на 96. Скважины специальной оптики пластины при постоянном распределении по всей поверхности лунки центрифуги составляют 5 000 ячеек и ресуспендируют в 300 микролитрах фенолового красного свободного нормального питательного материала в зависимости от общего количества клеток, содержащих необходимые лунки. Отрегулируйте количество ячеек и общий объем суспензионной среды.

Затем перенесите суспензию ячеек в 96-луночный планшет для засеивания ячеек на 96. Колодец специальной оптики с пластинами с максимальной плотностью ячеек в центре лунки. Осторожно добавьте 1 500 клеток в 15 микролитров фенолового красного свободного нормального питательного средства в небольшой капле в центр каждой лунки.

Это ограничит рост клеток до центра лунки. Дайте всем засеянным клеткам расти в течение не менее 18 часов в стандартных условиях культивирования клеток за 30 минут до начала процедуры окрашивания. Прогревание кватов фенола красного свободного нормального роста среднего до 37 градусов Цельсия.

Защелкивающейся подложкой в данной демонстрации является TMR star для удобства работы с TMR star растворенной TMR star в DMSO для получения стокового раствора с концентрацией 400 микромоляров, разведенных на 0,5 микролитра стокового раствора TMR star stock. В 200 микролитрах теплого фенола красного цвета выделяют нормальную питательную среду для получения конечной меченой концентрации в один микромоляр. Затем удалите нормальную питательную среду из асинхронно растущих клеток и замените меченой средой инкубацию клеток в меченой среде в течение 25 минут в стандартных условиях культивирования.

Через 25 минут удалите маркировочную среду и четыре раза промойте клетки теплой феноловой красной свободной средой для нормального роста. После окончательной промывки инкубируйте клетки в 300 микролитрах теплой феноловой красной свободной среды для нормального роста в течение 30 минут перед транспортировкой в микроскоп. Замените среду свежей, теплой средой для нормального роста, свободной от фенола, чтобы удалить остаточные несвязанные защелкивающиеся субстраты, транспортные клетки в микроскоп в пенополистироловой коробке на тепловом блоке с температурой 37 градусов Цельсия.

Свести к минимуму колебания температуры за два часа до измерения интенсивности флуоресценции. Отрегулируйте температуру воздуха климатической камеры до 37 градусов Цельсия в сухом режиме, чтобы довести микроскоп и все его компоненты до нужной температуры. Чтобы избежать образования конденсата и последующего повреждения микроскопа, важно провести предварительный подогрев перед установлением влажности.

Когда вся система микроскопа достигнет 37 градусов Цельсия, отрегулируйте влажность воздуха до 60% и углекислого газа до 5%. Запустите программное обеспечение для сканирования или сбора данных и определите стандартные настройки. Определите положение скважин, подлежащих анализу. Определите дельту T или время цикла сбора данных и абсолютное число циклов сбора данных.

В этой демонстрации. Аппаратный автофокус предварительно выбирается для анализа большего количества скважин. Начните сбор данных и контролируйте первые два цикла сбора данных.

Микроскоп будет фокусироваться на сигнале гистона H two GFP с последующим получением первого изображения в этом канале до замены фильтра и получения соответствующего изображения звезды TMR. Они повторяются для всех позиций в скважине и для каждой из скважин, подлежащих исследованию, перед повторением следующего цикла. Снова. Чтобы проанализировать протеолитические профили, запустите программное обеспечение для анализа scan R.

Проанализируйте изображения с ядрами клеток, визуализированные гистоном H two GFP, определенным как основной объект, с использованием порога, основанного на интенсивности сигнала, и алгоритма водораздела, помогающего в разделении соседних клеток. Для анализа звезды TMR необходимо создать субобъект, состоящий из ядра с цитоплазмой. Важными свойствами основного объекта являются положения по осям X и Y, время и максимум, а также средние интенсивности GFP для основного объекта и общая интенсивность, деленная на площадь.

Для подобъекта звезды TMR переключитесь в режим трассировки, чтобы визуализировать среднюю интенсивность флуоресценции звезды TMR с течением времени или следы клеток, назначенные анализируемым основным объектам. Рассмотрение большего числа клеток позволяет получить первое репрезентативное и объективное представление, но количество исследуемых клеток может быть сужено путем стробирования измерений, длящихся не менее 140 циклов и содержащих большую максимальную интенсивность гистона H 2 GFP. Выберите интересующую вас кривую клетки, чтобы визуализировать гистона H, две звезды GFP и звезду TMR одновременно на уровне одной клетки.

Используя правую кнопку мыши, щелкните по интересующей вас ячейке и сгенерируйте экспортируемую картинку. Галерея для иллюстрации гистона H two GFP и велосипеда B snap TMR звезда для каждого раза. Укажите на изменение режима заполнения программного обеспечения для анализа сканера и затворите область, в которой интересующая ячейка представлена на точечном блоте.

Примените новое окно точечной диаграммы к закрытой области и визуализируйте среднюю интенсивность флуоресценции звезды TMR с течением времени. Экспортируйте данные в Microsoft Excel для дальнейших расчетов. На рисунках здесь показана кинетика циклина B, представленная кривой интенсивности флуоресценции звезды TMR клетки, которая протекает через регулярный митоз без признаков хромосомного смещения при уплотнении цитоплазмы после распада ядерной оболочки или NEBD, как показано красным треугольником

Когда клетка входит в прометафазу, интенсивность флуоресценции остается на стабильном уровне до тех пор, пока клетка проходит через профазу и метафазу, а затем начинает быстро снижаться. Как только все хромосомы образуют стабильную метафазную пластину, это падение предшествует разделению хромосом. Во время анафазы, обозначенной синей точкой на кривой в позднем митозе, хроматин начинает конденсироваться и клетка принимает фазовую морфологию.

В то время как кривая интенсивности флуоресценции приближается к плато, которое ниже плато до митоза после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области митоза к изучению тесного баланса между цикличностью, деградацией и синтезом, который регулирует митотическую прогрессию.