Практические и новый метод для извлечения геномной ДНК из крови Комплекты Коллекция по сохранению белков плазмы

В данном видео будет описан практический и новый метод выделения геномной ДНК из новой системы консервации плазменных белков BDP 100, называемой пробирками P 100. Выделение ДНК из сыворотки и плазмы из обычных пробирок было довольно распространенной процедурой в прошлом, однако сочетание новых пробирок P 100 и представленного здесь метода экстракции предлагает новый, более простой подход к получению ДНК более высокого качества с гораздо меньшими усилиями. Внутренняя поверхность пробирки P 100 покрыта ЭДТА калия и ингибиторами протеаз.

Это предотвращает коагуляцию и стабилизирует белки плазмы. Кровь собирают в эти пробирки с целью получения плазмы для последующего тестирования после центрифугирования. Кровь в пробирке P 100 разделяется на слои в зависимости от плотности: плазма в верхней части, эритроциты в нижней и лейкоциты.

Слой лейкоцитов (buffy coat) находится между этими двумя слоями. Основным назначением таких пробирок обычно является получение плазмы. С использованием этой плазмы проводят ряд измерений, например, определение уровней антител и белков.

Слой лейкоцитов (buffy coat) обычно утилизируют, однако, как будет показано в данном видео, он содержит достаточное количество ДНК для проведения нескольких видов анализов, включая секвенирование, генотипирование, идентификацию биомаркеров и так далее. Система P one hundreds состоит из трех основных компонентов: колпачка, пробирки и сепаратора. Механический сепаратор перемещается в область непосредственно над слоем лейкоцитов.

Для получения доступа к лейкоцитарному слою (buffy coat) необходимо увеличить расстояние от сепаратора до этого слоя. Это достигается путем добавления 17% sucrose. Обычно лейкоцитарный слой утилизируется вместе с P 102, но, как будет показано в данном видео, из этого слоя можно легко извлечь достаточное количество ДНК для проведения нескольких аналитических тестов перед извлечением пробирок P 100 из морозильника при -80 °C.

Нагрейте водяную баню до 37 °C, поместите каждую пробирку P 100 в горячую водяную баню и инкубируйте около пяти минут для размораживания всех образцов. После полного размораживания всех образцов необходимо удалить любую сыворотку, оставшуюся над сепаратором. Затем над сепаратором добавляют 5 мл 17% сахарозы. После добавления сахарозы центрифугируйте все пробирки в течение 20 минут при 2 500 g. Теперь, когда сепаратор находится в верхней части пробирки и отделен от лейкоцитарного слоя, его можно легко удалить.

Распылите 70% этанол на химическую салфетку и стерилизуйте крючок из скрепки, тщательно протерев всю его поверхность. Держите пробирку P 100 под углом 45 градусов по отношению к стерильной скрепке. Начните извлекать разделитель из пробирки, осторожно потянув за край разделителя и направляя его в пакет для биоопасных отходов.

После извлечения сепаратора удалите как можно больше слоя 17% sucrose, стараясь не задеть слой лейкоцитов (buffy coat) и слой эритроцитов; теперь слой лейкоцитов должен стать верхним слоем в пробирке. Перенесите этот слой в новый промаркированный конический флакон объемом 15 миллилитров. Объем удаленного слоя лейкоцитов будет различаться для каждой пробирки, но должен составлять менее трех миллилитров.

Для нормализации объема во всех пробирках добавьте достаточное количество PBS (фосфатно-солевого буферного раствора), чтобы довести объем в каждой пробирке до 3 мл. Теперь, когда все лейкоцитарные слои суспендированы в равном объеме, любые оставшиеся эритроциты необходимо удалить, добавив 9 мл раствора для лизиса эритроцитов RBC.

Затем несколько раз переверните пробирки в течение 10 минут инкубации при комнатной температуре, чтобы отделить лизированные эритроциты от лейкоцитарного слоя. Центрифугируйте в течение пяти минут при 2 500 G; центрифугирование приведет к образованию осадка, из которого будет экстрагирована ДНК. Слейте отработанную жидкость из каждой пробирки в контейнер для биологически опасных жидких отходов, оставив небольшой объем, в котором будет ресуспендирован осадок. Перемешайте содержимое пробирки на вортексе, чтобы отделить и ресуспендировать осадок.

Добавьте 3 мл раствора для лизиса клеток и интенсивно перемешайте на вортексе в течение не менее 10 секунд. После лизиса клеток белки и ДНК окажутся свободноyспензенными в растворе и потребуют разделения; начните с осаждения белков, добавив 1 мл раствора для осаждения белков и перемешав на вортексе на высокой скорости в течение не менее 15 секунд. Затем центрифугируйте пробирки в течение пяти минут при 2 500 G для осаждения белков.

Сделайте соответствующие шаги. Промаркируйте один конический флакон объемом 15 миллилитров для каждого образца, переносимого в новую пробирку. Перенесите три миллилитра 100% изопропанола.

После того как белки будут осаждены и центрифугированы, в каждой пробирке должен образоваться относительно крупный осадок и прозрачный супернатант. Слейте супернатант, содержащий ДНК, из каждой пробирки в соответствующую пробирку с изопропанолом, подготовленную на предыдущем этапе; изопропанол должен вызвать осаждение ДНК в растворе в виде маленьких белых волокнистых нитей. Переверните все пробирки 50 раз для обеспечения тщательного перемешивания. Затем центрифугируйте все пробирки в течение трех минут при 2 500 G для формирования осадка ДНК; ДНК обычно видна в виде маленького белого осадка на дне пробирки. Однако при низком выходе ДНК она может быть не видна невооруженным глазом. Продолжайте экстракцию всех образцов до измерения концентраций.

Независимо от наличия осадка ДНК, удалите изопропанольный супернатант. Промойте ДНК, добавив 70% ethanol. Это позволит удалить все оставшиеся нежелательные компоненты, которые могут помешать последующему анализу; центрифугируйте в течение одной минуты при 2 500 G. Чтобы осадок ДНК надежно прикрепился к дну пробирки, удалите весь 70% ethanol из пробирок, затем переверните их на чистое бумажное полотенце для высушивания на воздухе в течение одного часа.

При продолжении протокола в пробирках не должно оставаться видимых следов этанола. Заключительным этапом экстракции является ресуспендирование ДНК в растворе. Для большинства экстракций подходящими вариантами являются либо раствор для гидратации ДНК, либо вода.

Для образцов, в которых наблюдается малое количество или полное отсутствие видимых нитей или осадка ДНК, добавьте на 250 мкл меньше раствора для гидратации ДНК. Затем осторожно и постепенно перемешайте ДНК на вортексе до полного суспендирования. Наконец, перенесите всю суспендированную ДНК в центрифужную пробирку. На этом этапе концентрацию и чистоту ДНК можно определить с помощью NanoDrop или другого спектрофотометра.

Как правило, ожидается, что чистота ДНК будет близка к чистоте ДНК, экстрагированной непосредственно из цельной крови, полученной в пробирках с ЭДТА калия, собранных исключительно для этой цели. Концентрация ДНК зависит от количества исходного материала, но может варьироваться от 50 nanograms per microliter до почти 1000 nanograms per microliter, при этом среднее значение составляет около 200 nanograms per microliter. Преимущество использования данного протокола двояко. Во-первых, он позволяет клиницистам использовать один забор крови для двух клинических тестов вместо двукратного забора крови.

Во-вторых, это упрощает процесс получения доступа к клеткам, содержащим ДНК, благодаря использованию современных пробирок с механическим сепаратором вместо пробирок предыдущих поколений. В пробирках с гелевым сепаратором предыдущего поколения как сам гелевый сепаратор, так и сгусток крови служили барьерами для клеток, содержащих ДНК. В пробирках P 100 механический сепаратор легко удаляется методом центрифугирования в 17% Sucrose.

На данном скриншоте представлены результаты измерения с помощью NanoDrop для типичной экстракции ДНК. При использовании данного метода для образца P 109 в результате экстракции был получен раствор объемом 250 µL с концентрацией ДНК 209 ng/µL. Общий выход составил около 52 µg.

Отношение 260/280, основной показатель чистоты ДНК, находилось в оптимальном диапазоне от 1.8 до 1.9 и составило 1.88. Вторичный показатель чистоты ДНК — отношение 260/230 — составило 2.35, что близко к ожидаемому диапазону от 2 до 2.2.

Это вполне типичные результаты. На практике выход и качество экстракции будут варьироваться в зависимости от объема и состояния крови перед экстракцией; анализ проводился с помощью стандартного гель-электрофореза с окрашиванием бромидом этидия. Дальнейшее тестирование качества показывает, что геномная ДНК, экстрагированная из пробирок P 100, так же неповреждена, как и ДНК, экстрагированная из цельной крови.

Это подтверждается наличием яркой толстой полосы в верхней части каждой лунки, содержащей геномную ДНК. Использование данного протокола вместо предыдущих методов дает два основных преимущества. Во-первых, он позволяет объединить две стандартные процедуры забора крови в одну.

Во-вторых, данный протокол является более быстрым и чистым по сравнению с протоколом, предполагающим использование типичных пробирок с гелевым разделителем SST. Благодаря устранению необходимости в рутинном разрушении сгустков крови, клиницисты берут две пробирки крови, когда требуются генетические и серологические тесты. Как правило, используется пробирка с гелевым разделителем SST (с золотой крышкой) и пробирка с ЭДТА калия (с фиолетовой крышкой); сыворотка отделяется от пробирки SST, а ДНК экстрагируется из пробирки с фиолетовой крышкой. При использовании данного метода достаточно взять одну пробирку P 100 с красной крышкой.

Хотя учреждения, знакомые с методом экстракции ДНК с использованием гелевого сепаратора, возможно, уже используют одну пробирку как для серологических, так и для генетических тестов, метод, представленный здесь, является постепенным, но существенным улучшением по сравнению с существующими методами с гелевым сепаратором. Оба метода требуют удаления того или иного сепаратора, при этом гелевые сепараторы обычно создают больше загрязнений, чем пластиковые.

При использовании пробирок с сепаратором требуется гомогенизация свернувшейся крови через проволочную сетку перед экстракцией ДНК. Этот процесс гомогенизации может быть трудоемким, а экстракция ДНК затрудняется при наличии значительного количества эритроцитов, не содержащих ДНК. Метод экстракции P 100 позволяет отделить содержащие ДНК лейкоциты от гематокрита, сводя к минимуму количество эритроцитов, препятствующих экстракции ДНК.

Данная система выделения ДНК из пробирок для плазмы P 100 вместо трубок с гелевым сепаратором предыдущего поколения обладает множеством преимуществ. Пробирки P 100 содержат ЭДТА, который ингибирует магний-зависимую эндонуклеазу, и антикоагулянт для предотвращения свертывания крови. Конечным результатом является более высокая целостность ДНК при значительно более простом протоколе экстракции, а именно за счет исключения необходимости измельчения и гомогенизации свернувшейся крови.

Кроме того, кровь с удаленной плазмой может храниться в пробирках объемом 100 мл бессрочно (до трех лет) до момента необходимости экстракции ДНК. Более того, клиницисты смогут получать более полезные данные о пациентах при меньшем количестве заборов крови, что снизит уровень стресса у пациентов, проходящих данные процедуры.