Эксплантов анализа для оценки сотовой поведение черепно Мезенхима

Целью данной процедуры является мониторинг поведения культуры краниальных мезенхимальных клеток в определенных условиях культивирования. Первым шагом является забор рогов матки у мыши с точно определенным сроком беременности.

8,5 дней после коитуса. После изоляции эмбрионы извлекают из децидуальной оболочки, и желточный мешок удаляют для генотипирования. Затем отделяют краниальные отделы, проводят микродиссекцию и переносят ткани на планшеты для культивирования, покрытые внеклеточным матриксом.

Эксплантам X дают время для прикрепления, после чего их культивируют до 48 часов в присутствии или отсутствие определенных фармакологических агентов. В конечном итоге делают снимки экспланта, чтобы показать различия в миграции клеток. Этот метод полезен для ответа на ключевые вопросы, такие как: какие сигнальные пути и белки внеклеточного матрикса задействованы и контролируют поведение краниального гребня во время подъема нейральных складок.

Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, поскольку этапы микродиссекции трудно освоить, и для их овладения требуются терпение и практика. Для начала, если планируется проведение иммуногистохимического анализа, подготовьте покровные стекла; в противном случае пропустите этот шаг и перейдите непосредственно к покрытию планшетов для культивирования тканей внеклеточным матриксом (ECM). Стерилизуйте круглые стеклянные покровные стекла диаметром 12 мм, погрузив их в этанол. Дайте им высохнуть на воздухе. Затем поместите одно стерилизованное покровное стекло в каждую лунку 12-луночного планшета.

Работая в ламинарном шкафу, нанесите 1 mL внеклеточного матрикса (ECM) для покрытия покровных стекол или дна планшета для культивирования тканей. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение трех часов. После инкубации аспирируйте раствор ECM и трижды промойте PBS. На этом этапе покрытые планшеты можно использовать сразу или завернуть в пленку и хранить при 4 °C до двух недель.

Помогает в визуализации полупрозрачного эмбриона. Подготавливают предохранительные пластины Syl guard с устойчивым черным фоном в соответствии с протоколом производителя.

Подготовьте инструменты для диссекции, вставив тонкую булавку в держатель. Когда всё будет готово, используйте точильный блок для заточки пинцетов. Извлеките матку у беременной мыши с точно определенным сроком беременности (8,5 дней после коитуса).

Поместите изолированную матку в чашку со стерильным PBS и промойте. Под диссекционным микроскопом отделите отдельные участки децидуальной оболочки с помощью ножниц и пинцета. Удалите соединительную ткань матки разрывающим движением, стараясь не оказывать давления, чтобы эмбрион не выскочил из децидуальной оболочки.

С помощью пинцета аккуратно разорвите ткани матки с противоположной от плаценты стороны. Чтобы обнажить эмбрион, заключенный в желточный мешок, зажмите пинцетом эмбрион вместе с желточным мешком, отделяя их от плаценты, и удалите ткани матки из чашки. Затем, осторожно разрывая ткани пинцетом, удалите желточный мешок от эмбриона.

С помощью пипетки перенесите желточный мешок в пробирку Эппендорфа для генотипирования; после выделения определите стадию развития эмбриона по количеству сомитов. В идеале эмбрион должен находиться на стадии от 6 до 10 сомитов. На этом этапе нейральные складки только начинают подниматься, а основные процессы морфогенеза краниальной мезенхи еще не произошли.

После определения стадии развития перенесите эмбрион на черную планшетную пластину с защитной сеткой, содержащую DMEM без фенолового красного. Сначала под диссекционным микроскопом с максимально возможным увеличением сфокусируйтесь на голове эмбриона; удерживая диссекционные иглы в каждой руке, отделите голову передней части rmba meres. Затем сделайте разрез по срединной линии для би.

Разделите голову на две равные половины, используя диссекционную иглу в каждой руке. Удалите внешние края вдоль границы головы эмбриона и срединной линии. Удаляйте лишние ткани по мере необходимости, чтобы избежать путаницы между искомым пластом и нежелательными тканями.

Эксплантат будет содержать мигрирующий черепной нервный гребень, параксиальную мезодерму и поверхностный эктодерму; удалите слабо прикрепленные клетки. Осторожно произведите пипетирование вверх-вниз с помощью наконечника дозатора на 200 µL. Затем аккуратно захватите эксплантат кончиком наконечника дозатора.

Примерно в 10 µL DMEM поместите в центр лунки покрытой чашки для культивирования тканей 20 µL теплого DMEM, дополненного 15% FBS; теперь чашку с культурой можно перенести в инкубатор для культивирования тканей. Примерно через один-два часа эксплантат прикрепится, после чего можно добавить еще 250 µL среды. Примерно через 24 часа эксплантат будет плотно прикреплен к покровному стеклу.

На данном этапе фармакологические агенты можно добавить в среду через дополнительные 24 часа, после чего клетки начнут мигрировать из этих областей. Обычно делают снимки для документирования расстояния и количества клеток, мигрировавших из указанных зон. В этот момент при более длительной инкубации начинают проявляться признаки снижения жизнеспособности клеток.

Ниже представлены примеры миграции клеток из эксплантатов черепного мезенхимального эпителия и цыплячьих эмбрионов. Через 48 часов на различных субстратах как форма, так и размер клеток, мигрирующих из эксплантата, зависят от типа субстрата. Миграция поддерживалась на фибронектине, ламинине, Matrigel, компонентах внеклеточного матрикса и гиалуроновой кислоте.

После выполнения данной процедуры можно использовать другие методы, такие как иммунофлуоресценция и визуализация живых клеток, для дальнейшего изучения путей, регулирующих поведение черепного мезенхимального слоя во время подъема нейральных складок.