Модели костных метастазов

Общая цель данной процедуры заключается в инъекции опухолевых клеток таким образом, чтобы индуцировать их рост в кости с последующим разрушением костной ткани. Для этого сначала опухолевые клетки ресуспендируют в холодном PBS и помещают на лед. Затем соответствующее количество клеток вводят в левый желудочек сердца или в большеберцовую кость анестезированной мыши.

Затем с помощью нескольких методов визуализации проводится лонгитюдный мониторинг роста опухоли и параметров кости. В завершение выполняется количественная оценка параметров опухоли и кости в конечной точке. В конечном итоге используется комбинация методов флуоресцентной или люминесцентной визуализации in vivo и ex vivo, а также 2D-рентгенографии и 3D-визуализации.

Микро-КТ и гистология используются для демонстрации роста опухоли и изменений в микроокружении кости на клеточном и структурном уровнях. Эти методы помогают ответить на ключевые вопросы в области метастазирования рака, например, какие факторы в костной ткани способствуют метастатической колонизации при раке молочной железы и предстательной железы. Подготовку клеток продемонстрирует Алиса Меркель, лаборант-исследователь моей лаборатории; поддерживайте жизнеспособность клеток не более одной недели.

Клон M-D-A-M-B 2 3 1 с GFP-меткой культивируют в среде DMEM, содержащей 10% FBS и 0,1 mg/mL пенициллина-стрептомицина, при 37 °C в атмосфере с 5–8% CO₂. При достижении клетками 80–90% конфлюэнтности проводят пассирование клеток с разведением 1:10. Для подготовки клеток к инокуляции при 80–90% конфлюэнтности их трипсинизируют с использованием 10 mL 0,15% трипсин-ЭДТА.

Перенесите клетки в коническую пробирку объемом 50 мл с ледяной средой DMEM с 10% FBS и центрифугируйте в течение пяти минут. Ресуспендируйте осадок в конической пробирке объемом 50 мл в 25 мл ледяного PBS без кальция и магния и подсчитайте количество клеток, затем доведите концентрацию клеток в ледяном PBS до 10⁶ клеток на мл для интракардиального введения и до 250 000 клеток на мл для внутрибольшеберцового введения.

Для данных экспериментов используются самки иммунодефицитных мышей в возрасте от четырех до шести недель, которых за пять-десять дней до инъекции кормили рационом Tela 29 20 x. После наркотизации мыши в камере с 2,5% isof fluorine переместите животное под вентиляционный вытяжной шкаф к носовому конусу и уложите его на спину. Промойте область грудной клетки 10% раствором повидон-йода, затем 70% Ethanol.

Отметьте место инъекции на грудной клетке мыши посередине между яремной вырезкой и верхушкой мечевидного отростка, немного левее грудины. Затем, используя инсулиновый шприц объемом 300 мкл с иглой 28G длиной 1/2 дюйма, наберите небольшой пузырек воздуха, чтобы создать пространство между поршнем и мениском, и наберите 100 мкл суспензии клеток, удерживая кожу мыши в натянутом состоянии одной рукой.

Держите иглу вертикально; при успешном введении в левый желудочек сердца в шприце должен появиться отчетливый ярко-красный пульсирующий поток крови. На этой глубине осторожно нажмите на поршень шприца, избегая значительного смещения иглы, чтобы не проколоть сердце и не допустить вытекания клеток в грудную полость. Чтобы уменьшить вытекание клеток в грудную полость, слегка потяните поршень на себя, создавая небольшое отрицательное давление.

Затем извлеките иглу из грудной клетки, стараясь не наклонять её во время извлечения, так как это может привести к разрыву сердечной оболочки и кровотечению. В течение примерно одной минуты осторожно надавливайте на место инъекции, чтобы остановить кровотечение. Снимая конус для носа, перенесите мышь на грелку до полного восстановления сознания.

Непосредственно перед проведением внутрибольшеберцовой процедуры введите мыши бупренорфин. После наркотизации мыши и её размещения в носовом конусе очистите обе конечности 10% раствором повидон-йода, затем этанолом, используя технику четырех пальцев и большого пальца.

Осторожно обхватите латеральную лодыжку, медиальную лодыжку и нижнюю половину большеберцовой кости. Затем согните ногу так, чтобы коленный сустав был виден и доступен. С помощью 70% ethanol смочите кожу для повышения видимости подлежащей связки надколенника, которая при плотном захвате голеностопного сустава должна выглядеть как отчетливая толстая белая линия.

Введите иглу калибра 28 длиной 1/2 дюйма под надколенник через середину связки надколенника в переднюю межмыщелковую область в верхней части большеберцовой кости. Прикладывая устойчивое и сильное давление с легкими вращательными движениями, осторожно проведите иглу через зону роста. После прохождения зоны роста большеберцовой кости сопротивление при продвижении иглы заметно снизится.

Осторожно перемещайте иглу в латеральном направлении, чтобы убедиться, что она находится в большеберцовой кости и прошла через зону роста. Если игла расположена правильно внутри большеберцовой кости, ее подвижность будет ограничена. Медленно нажмите на поршень, чтобы ввести 10 µL клеточного раствора.

На данном этапе сопротивление должно быть минимальным или отсутствовать вовсе. Затем медленно извлеките иглу. Выведите мышь из наркоза и держите ее на грелке до полного восстановления.

Наблюдайте за мышью два-три раза в неделю. На обезболиваемых животных проводят различные методы визуализации, такие как люциферазный анализ, флуоресценция GFP и рентгенография. Флуоресценция указывает на области расположения опухоли.

Для локализации очагов поражения используется эстрон-сканирование. Очаги поражения коррелируют с изображениями флуоресценции. Более подробная информация о методах визуализации представлена в текстовой части данного протокола.

Через 21–35 дней после инъекции. Выполните эвтаназию мышей методом, одобренным IACUC, и поместите кости в 4% Formalin. Проведите ex vivo анализ с использованием микро-КТ и гистоморфометрии с окрашиванием гематилином и DSN выделенных костей. Подробную информацию можно найти в письменном протоколе, следующем за интракардиальным или интратибиальным введением опухолевых клеток.

Состояние мышей еженедельно контролируют с помощью рентгенографии, а также флуоресценции или люминесценции. Повреждения обычно становятся заметными на рентгенограммах между второй и третьей неделями. Хотя при использовании данной модели они могут быть видны при флуоресценции и люминесценции уже на второй неделе, на рентгеновских снимках повреждения выглядят как темные отверстия в кости и могут становиться более выраженными с течением времени. Количественная оценка повреждений проводилась с помощью анализа рентгенограмм и флуоресцентных изображений в программе MetaMorph.

Количественный анализ проводили с помощью программного обеспечения для получения и анализа изображений Maestro. На данном рисунке потеря костной ткани определена с помощью микро-КТ анализа. Данные о структуре и минерализации кости, полученные при микро-КТ измерениях, представлены в виде 3D-изображений здоровой кости и кости с опухолью, где области разрушения кости отображены в виде пустот.

Затем в образцах проводили гистоморфометрический анализ для определения опухолевой нагрузки и отношения объема кости к объему ткани. При выполнении этих процедур важно проявлять терпение, аккуратно располагать каждую мышь и внимательно следить за их состоянием. Если животные начинают погибать, вероятной причиной является агрегация клеток; в таком случае следует немедленно подготовить новую клеточную суспензию.

Худшее, что можно сделать, — это торопиться при выполнении процедур или поддаваться раздражению. Помните, что с практикой и временем вы будете выполнять эти действия лучше и быстрее. Разработка данных методов открыла исследователям рака путь к изучению метастазов в костях in vivo.