Бактериальные обнаружения и идентификации с использованием электрохимических датчиков

Общая цель данного эксперимента заключается в обнаружении и идентификации бактерий с помощью электрохимических датчиков. Это достигается путем первого высвобождения рибосомальной РНК из бактерий для обеспечения гибридизации с фторированным детекторным зондом, в качестве второго шага рибосомная РНК, связанная с детекторным зондом, добавляется к рабочему электроду, что позволяет проводить гибридизацию с захватным зондом на поверхности сенсора. Затем конъюгат антифлуоресцеиновой пероксидазы хрена связывается с фторированным детекторным зондом.

Наконец, в интерферометрическом токе, интенсивность которого коррелирует с числом рибосомальных зондов захвата, можно получить зондовые комплексы РНК-детектора на поверхности сенсора. Основное преимущество этого метода перед методами, основанными на культивировании, заключается в том, что бактерии могут быть обнаружены и идентифицированы примерно за 45 минут, что позволяет избежать ночного веса. Для того, чтобы бактерии образовали видимую колонию на планшете EDGAR, применение этого метода улучшит лечение инфекционных заболеваний.

Поскольку раннее выявление бактериальных патогенов имеет важное значение для таргетной антибиотикотерапии и улучшения клинических результатов. Хотя этот метод полезен для диагностики инфекционных заболеваний, он также может быть применен для других диагностических проблем, таких как иммунодиагностика. Начните с инкубации расширенного зонда захвата с гексаном дитиолом в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы убедиться, что тиоловая группа на зонде захвата уменьшается, что приводит к более стабильным результатам.

После инкубации внесите струю азота, чтобы вывести золото. 16 чипов сенсорной матрицы в течение пяти секунд удаляют любую влагу или твердые частицы, Небольшие объемы жидкости необходимо осторожно нанести на рабочий электрод в сенсорной решетке. Визуальная демонстрация этой техники имеет решающее значение.

Поскольку правильное выполнение методов пипетирования и промывки и сушки значительно снижает вариабельность чипа к чипсу. Затем нанесите шесть микролитров смеси расширенного зонда захвата HDT на рабочий электрод всех 16 датчиков сенсорного массива и храните чипы датчиков в закрытой чашке Петри при температуре четыре градуса Цельсия на ночь следующего дня, промойте чипы датчиков деионизированной водой в течение двух-трех секунд, а затем высушите чипы под струей азота в течение пяти секунд. Теперь нанесите шесть микролитров аттри гидрохлорида натрия хлорида, раствор меркаптоэтанола ЭДТА на рабочий электрод всех 16 датчиков и инкубируйте датчики в течение 50 минут в чашке Петри при комнатной температуре.

Подготовить образцы к электрохимическому сенсорному анализу. Перенесите один миллилитр бактериальной культуры в логарифмической фазе роста в микроцентрифужную пробирку, а затем центрифугируйте клетки в течение пяти минут при давлении 16 000 г. Обратите внимание, что с болезнетворными бактериями следует обращаться в капюшоне.

После удаления сната приложите наконечник для дозатора, содержащий 10 микролитров одного молярного гидроксида натрия, на дно микроцентрифужной пробирки и несколько раз проведите пипеткой вверх и вниз, чтобы полностью повторно суспендировать гранулу. После инкубации суспензии при комнатной температуре в течение пяти минут добавьте 50 микролитров PBS, содержащего бычий сывороточный альбумин или BSA, и модифицированный флуоресцеином детекторный зонд для нейтрализации бактериального лизата. Затем инкубируйте нейтрализованный лизат в течение 10 минут при комнатной температуре.

Начните этот шаг с промывки раствора меркаптоэтанола с одного из подготовленных чипов датчика деионизированной водой в течение двух-трех секунд. После высыхания чипа, как только что продемонстрировано, нанесите на рабочие электроды четыре микролитра лизата нейтрализованных бактерий. 14 датчиков.

Затем нанесите четыре микролитра мостикового олигонуклеотида в модифицированном детекторном зонде PBS плюс BSA плюс флуоресцеин на два положительных контрольных сенсора. Затем, после инкубации лизата и положительного контроля датчиков в течение 15 минут, промойте и затем высушите весь чип датчика, как и раньше. Теперь нанесите четыре микролитра антифлуоресцеиновой пероксидазы хрена или HRP в PBS, содержащей казеин, на рабочие электроды всех 16 датчиков.

После 15-минутной инкубации вымойте и высушите чип датчика. Далее наклейте пленочный колодец наклейки на поверхность сенсорной микросхемы и загрузите микросхему в сенсорную микросхему крепления пипетки 50 микролитров подложки TMB на все 16 сенсоров и закройте крепление сенсорной микросхемы. Наконец, используйте считыватель чипов Helios для получения пирометрических и циклических телеметрических измерений для всех 16 датчиков.

Только что описанный электрохимический анализ структурирован аналогично бутерброду, Элиза, как показано на рисунке рибосомальной мишени, гибридизация РНК с зондами захвата и детектора осуществляется в результате окислительно-восстановительной реакции, катализируемой HRP, сопряженным с фрагментами антифлуоресцеиновых антител, которые связывают связь трех сосновых флуоресцеиновых антител на детекторном зонде. Важным компонентом чувствительности пробы является химический состав поверхности золотого электрода. Золотой электрод покрыт меркаптоэтанолом и гинеолом и функционализирован путем добавления расширенных зондов захвата.

Сэндвич-гибридизация рибосомальной РНК-мишени с зондом захвата и меченым флуоресцеином детекторным зондом приводит к образованию комплекса, который детектируется добавлением конъюгата антифлуоресцеиновой пероксидазы хренской редьки и субстрата TMB. Параметрический ток М генерируется окислительно-восстановительным циклом, который возникает в результате окисления ТМБ пероксидазой хрена и восстановления ТМБ электронами электрода. В продемонстрированных здесь анализах используется чип сенсорной матрицы gene fluidic 16.

Каждый из датчиков в массиве содержит три электрода, рабочий эталонный и вспомогательный, которые имеют точки контакта на краю чипа. Считыватель чипов имеет пого-контакты, которые соединяются с каждой из точек контакта. Считыватель чипов служит интерфейсом для матрицы датчиков с потенциометром, управляемым компьютерным алгоритмом.

Здесь приведены примеры протекания тока электрохимического датчика. Протекание тока в датчиках искусственно завышено в течение первых нескольких секунд после начала параметрических измерений. Из-за накопления окисленной подложки в течение времени от нанесения TMB на поверхность датчика до запуска алгоритма считывания, поток тока быстро достигает устойчивого состояния, и точные показания датчика могут быть надежно получены в течение 60 секунд.

Вариабельность от датчика к сенсору относительно постоянна, поэтому возможно параллельное выполнение 16 различных сенсорных анализов на гене Fluidic 16 Чип чипа с положительным и отрицательным контролем имеет важное значение в качестве положительного контроля. Таким образом используется синтетический мостиковый олигонуклеотид ДНК, который гибридизуется как с зондом захвата, так и с детекторным зондом и служит синтетической мишенью известной концентрации. Результаты получены с использованием мостиковой олигонуклеотидной функции в качестве внутреннего калибровочного контроля для минимизации вариаций от чипа к чипу.

Чем больше отрицательный ток электрода, тем выше сигнал. При тестировании датчиков захвата и детектора. Предел обнаружения должен определяться путем последовательного разведения пробы известной концентрации, как показано на этом рисунке, существует линейная логарифмическая корреляция между концентрацией образца и выходным сигналом в динамическом диапазоне анализа.

На этих гистограммах репрезентативные результаты для образцов, содержащих esia coli и kleb seal и аммиак, которые часто обнаруживаются в моче пациентов с инфекцией мочевыводящих путей, показывают, что сигналы для большинства датчиков будут низкими и схожими, и эти отрицательные результаты могут быть объединены, поскольку реактивность фонового сигнала с парой зондов KE отличает canon от e. coli. Мостиковый олигонуклеотид служит положительным контролем и внутренним калибровочным стандартом. Этот метод может быть применен для обнаружения устойчивых к антибиотикам бактерий в клинических образцах путем измерения фенотипической реакции бактерий на антибиотики.

Эта методика может быть использована для определения оптимальной терапии для конкретного пациента. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как обнаруживать и идентифицировать бактерии, сравнивая токи в различных датчиках в чипе.