Производство и использование контрейлерные Multibarrel Электроды для В естественных условиях Фармакологические манипуляции нейронных ответов

Данная процедура предназначена для ионофоретического введения фармакологических агентов в микроцепи мозга с одновременной записью нейронной активности. Сначала вытяните одноканальный стеклянный электрод для регистрации активности одиночных клеток и согните его кончик. Также вытяните многоканальный стеклянный электрод и обломите его кончик до достижения требуемого диаметра.

Приступите к сборке двух электродов. В конечном итоге полученный электрод используется для внеклеточных записей in vivo, при которых по мере необходимости можно применять фармакологические агенты для манипулирования нейронными микроцепями. Здравствуйте, меня зовут доктор Ахим Клю, и сегодня наша лаборатория покажет вам, как изготовить многоканальные электроды типа «piggyback».

Эти электроды могут быть использованы для ионофореза нейральных агонистов и антагонистов в микроокружение нейрона и, таким образом, для манипулирования нейронными цепями нейрона in vivo. Здравствуйте, я доктор Ан Зиллоу. Я посток в лаборатории доктора А. Хима Кроу, и сегодня я продемонстрирую эту процедуру. Для изготовления одноканального электрода используйте одноканальный стеклянный капилляр с нитью и вытяните кончик до диаметра примерно 1–2 µm при длине стержня 10–12 mm.

Периодически проверяйте сопротивление вытянутого электрода, заполняя его трехмолярным раствором хлорида натрия и тестируя с помощью стандартного омметра в 0,9% физиологическом растворе. После заполнения электрода солевым раствором тот быстро высыхает, что делает электрод непригодным к использованию. Поэтому проводите данное тестирование только при необходимости.

Отберите несколько электродов, которые не будут использоваться для создания многоканального («piggyback») электрода. Чтобы изготовить полноценный многоканальный электрод, вытяните стекло до получения кончика пипетки с общим диаметром около 10 micrometers или менее. Наличие электрода с правильно вытянутым кончиком является критически важным фактором успеха.

Помимо того, что кончик должен быть длинным и тонким, он также должен оставаться твердым и легко обламываться до желаемого диаметра. В следующем шаге кончик будет обломан до нужного диаметра. Таким образом, при объединении капель точный размер кончика менее критичен, чем общая форма наконечника электрода, который должен быть длинным и относительно тонким.

Теперь удерживайте одноканальный электрод под углом примерно 45 градусов кончиком вниз и относительно быстро перемещайте его через пламя. Стремитесь к тому, чтобы пламя расплавило стекло в переходной области примерно в 10 миллиметрах от кончика электрода, чтобы согнуть его примерно на 20 градусов. Поместите многоканальный электрод в слой модельной глины на предметном стекле, а затем установите его на предметный столик микроскопа.

Держатель предметного стекла. Используя XY-манипуляторы предметного столика микроскопа, осторожно прижмите кончик электрода к кусочку плексигласа. Наблюдайте за сколом кончика через окуляры микроскопа. Схема установки электрода показана здесь.

Многоканальный электрод закреплен на предметном стекле на столике микроскопа. Одноканальный электрод удерживается ручным многоосевым манипулятором, который позволяет пользователю с высокой точностью опустить одноканальную пипетку на многоканальную. Опустите одноканальный электрод непосредственно в паз многоканального электрода, образованный расположением пяти каналов, так, чтобы его кончик выступал за кончик многоканального электрода примерно на 5–10 micrometers.

Склейте стержни двух электродов с помощью цианоакрилата. Начните с позиции, наиболее удаленной от кончиков, и медленно перемещайте зубочистку с каплей клея вдоль стержней электродов по направлению к их кончикам. Нанесение клея слишком близко к кончикам электродов приведет к их засорению, что сделает электрод как минимум частично нефункциональным.

Смешайте небольшое количество стоматологического цемента. Дайте ему высохнуть в течение примерно 15 минут. Затем осторожно извлеките готовый вспомогательный электрод.

Сначала отсоедините электрод от держателя микроманипулятора, а затем от предметного стекла. Непосредственно перед использованием электрода подготовьтесь к заполнению каждого канала соответствующим препаратом. Заполните четыре внешних канала пятиканальной конфигурации четырьмя выбранными препаратами, а центральный канал — 3 M раствором NaCl в качестве балансирующего канала.

Затем заполните одноканальный регистрирующий электрод 3 M раствором хлорида натрия. Включите модули ионного переносного насоса и протестируйте все каналы. Функция тестирования электродов каждого насосного модуля поможет определить, пригоден ли канал электрода для глубокой регистрации активности мозга.

Готовый пятиствольный электрод, собранный вместе с одноствольным регистрирующим электродом, имеет длинный стержень длиной около семи миллиметров. Для ионтофореза обычно используют несколько синаптических агонистов и антагонистов, чтобы заблокировать глициновое торможение с помощью таких препаратов, как антагонисты глициновых рецепторов. Гидрохлорид стрихнина обычно увеличивает частоту разрядов нейронов.

Эти नमूрные данные измеряют функцию зависимости частоты разряда слуховых нейронов от интенсивности и демонстрируют ответы на синусоидальные звуковые стимулы возрастающей интенсивности, подаваемые в уши животного. Более громкие звуки приводили к более высоким частотам спайков до применения строгого nine. Функция зависимости частоты разряда нейронов от интенсивности демонстрирует низкие частоты спайков.

Подача начального тока ионтофореза силой 15 nano amps стимулирует небольшое увеличение тока выброса. Постепенное увеличение тока выброса приводит к блокировке все большего числа глициновых рецепторов нейрона, что вызывает прогрессивное повышение частоты разрядов. При токе 45 nano amps все глициновые рецепторы данного нейрона, по всей видимости, блокируются стрихнином гидрохлоридом.

Дальнейшее увеличение тока выведения и высвобождение еще большего количества вещества не привели к дополнительным изменениям. Функциональный уровень частоты разрядов нейронов после прекращения ионтофореза возвращается к исходному состоянию примерно через 25 минут. Этот процесс восстановления зависит от типа и количества выведенного препарата.

Важно помнить, что препарат будет диффундировать в область места регистрации и может также блокировать рецепторы соседних нейронов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как сочетать регистрирующий электрод с многоканальным электродом для введения препаратов, чтобы обеспечить глубокую регистрацию активности мозга с низким уровнем шума, а также контролируемую по времени подачу до четырех фармакологических агентов.