13 февраля 2013 г.
Мы продемонстрируем, как использовать технику RNAi кормления, чтобы сбить генов-мишеней и оценка размеров тела фенотип C. Элеганс. Этот метод может быть использован для большого экрана масштаба для выявления потенциальных генетических компонентов интереса, таких как тех, кто участвует в размерах тела регулирования DBL-1/TGF-β сигнализации.
В этом видео демонстрируется процедура идентификации генов, которые регулируют, см. рост элганов и размер тела. С помощью РНК-интерференции или РНК-глаза для инактивации генов-кандидатов получают первые пластины, содержащие бактерии, экспрессирующие двухцепочечную РНК, которые нацелены на интересующие гены. Гермафродиты четвертой личиночной стадии переносятся на пластины РНК-интерференции.
Как только они достигают стадии молодого взрослого человека, их пересаживают на новые пластины RNAI для откладывания яиц. Через несколько часов они удаляются, оставляя синхронизированные популяции эмбрионов. На нужной стадии развития потомство собирают и устанавливают на предметные стекла.
Наконец, получаются микроскопические изображения червей. Анализ изображения демонстрирует изменения в размерах тела, вызванные инактивацией генов. Хотя этот метод может быть использован для идентификации регуляторов сигнального пути TGF beta, он также может быть применен к другим путям, которые регулируют постэмбриональное развитие в морской элегантности, таким как сигнальный путь инсулина.
Начните эту процедуру с клонирования целевых последовательностей генов в вектор L 4 4 4 0 Обычно используемая РНК-интерференционная плазмида червя преобразует рекомбинантную плазмиду в бактериальный штамм. HT one 15 DE три культуры. Преобразованные бактерии на агаровых пластинах LB с 25 микрограммами на миллилитр углекислого газа и 12,5 микрограммами на миллилитр тетрациклина, затем выбирают один клон для будущего использования.
Тем временем преобразуем пустой вектор L 4 4 4 0 в бактериальный штамм. HT один 15. Для использования в качестве контрольной культуры для экспериментов трансформированные бактерии в одном миллилитре бульона LB содержали 100 микрограммов на миллилитр ампициллина в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.
Тетрациклин не добавляют, потому что он снижает эффективность RNAI. Добавьте еще пять миллилитров бульона LB со 100 микрограммами на миллилитр ампициллина в ночную культуру, затем инкубируйте еще четыре-шесть часов при температуре 37 градусов Цельсия. Как только культура будет готова, засейте 0,5 миллилитра экспериментальных или контрольных бактерий на червячные пластины RNAI, помеченные соответствующим названием клона.
Для каждого условия должно быть подготовлено не менее двух тарелок. Инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день.
Должна присутствовать лужайка из бактерий, экспрессирующих РНК-интерференцию с целевой последовательностью гена или без нее. Животные будут использовать бактерии в качестве источника пищи. Как только подающие пластины RNAI готовы, пламя стерилизует кончик платиновой проволоки.
Затем с помощью платиновой проволоки перенесите от шести до десяти четвертых личиночных стадий или L четырех гермафродитов C elgan на каждую пластину РНК-интерференции. Дайте гермафродитам вырасти при температуре 20 градусов Цельсия за ночь. На следующий день животные будут молодыми взрослыми.
Перенесите их на новую соответствующим образом маркированную и подготовленную пластину RNAI. Инкубируйте пластины при температуре 20 градусов Цельсия в течение четырех-шести часов, чтобы взрослые особи могли отложить яйца. После инкубации удалите всех взрослых особей из планшета, чтобы синхронизировать потомство.
Как только взрослые особи будут удалены, начните считать время. Это нулевое время. Инкубируйте планшеты при температуре 20 градусов Цельсия, чтобы животные выросли до интересующей стадии развития.
Здесь будут отобраны молодые люди для фенотипического анализа. Для нокдаунов, которые развиваются с нормальной скоростью, требуется 72-часовая инкубация. Имейте в виду, что различные гены по-разному влияют на развитие животных, поэтому время инкубации может потребоваться скорректировать.
Если РНК-интерференция заставляет животных расти с другой скоростью, молодые взрослые особи могут быть идентифицированы как те, у кого не более 24 часов после L четыре с завершенным развитием VUL и от двух до шести эмбрионов в матке, как показано здесь. Чтобы определить другие стадии развития, исследователь должен использовать в качестве ориентира развитие гонад и ВУЛ. Как только животные вырастут до соответствующей стадии, приготовьтесь к оценке размера тела фенотипов червей, обработанных РНК-интерференцией.
Далее поместите два слоя цветной этикеточной ленты на стекло толщиной в один миллиметр образец предметного стекла, как показано здесь. Сделайте две такие стеклянные горки. Затем поместите между двумя предметными стеклами новое предметное стекло с помощью ленты и нанесите каплю 2%-ного агроса, растопленную в воде.
К центру нового предметного стекла прижмите сверху второе предметное стекло, чтобы получилась тонкая агрос подушечка. Как только агрос застынет, снимите верхнее стекло. Сдвиньте горку с агрос подушечкой, готовой к загрузке червей.
Подпишите слайд именем клона. Добавьте 10 микролитров 25 миллимолярного азида натрия в подушечку aros. Затем, используя платиновую проволоку, как и раньше, пересадите от 30 до 40 животных в раствор ази натрия.
Чтобы обездвижить их, наденьте сверху крышку. Проделайте это как для рекомбинантных, так и для пустых животных L 4 4 4 0, несущих РНК-интерференцию. Затем поместите предметное стекло под препарирующий микроскоп с объективом 2,5 раза.
С помощью Q Capture или аналогичного программного обеспечения сделайте снимок микрометровой линейки и сохраните его. Затем поместите червей под прицел и сделайте снимки. Чтобы сначала измерить длину тела, откройте изображение линейки микрометра в программе Image Pro.
Затем нажмите на «Измерить» и выберите «Калибровка». Затем выберите мастер пространственной калибровки с калибровкой выбранного активного изображения. Нажмите на кнопку «Далее».
Введите имя калибровки и убедитесь, что единицы пространственной привязки установлены в микронах. Затем отметьте кнопку «Создать эталонную калибровку» и нажмите «Далее». Нажмите на нарисовать опорную линию.
Появится эталонная масштабная линейка. Переместите масштабную линейку в соответствии с концами микрометра. Затем укажите, что в ссылке указано 1000 единиц.
Нажмите OK. Далее и финиш. После калибровки программного обеспечения откройте изображение червя.
Затем в меню измерения выберите калибровку, а затем нажмите выбрать пространственную. В раскрывающемся меню выберите имя файла, созданного для калибровки микрометра. Затем в открывшемся окне под меню измерений выберите измерения.
Выберите свободный инструмент рисования и с помощью компьютерной мыши проведите линию через центр тела животного от головы к хвосту. Длина будет указана в окне. Повторите этот процесс для всех животных в поле.
Экспортируйте измерения длины в файл Microsoft Excel или другое подходящее статистическое программное обеспечение. Проанализируйте данные, вычислив среднее значение и стандартное отклонение для каждой выборки. Затем сравните результаты для каждой группы с помощью Т-критерия ученика.
Трансформирующий фактор роста бета или белок семейства TGF beta DBL one необходим для активации пути TGF beta. В ответ на активацию сигнала внутриклеточные преобразователи сигнала smad перемещаются в ядро и инициируют транскрипцию генов. Смотрите элегантность, при которой путь TGF beta нарушается, имеют меньший размер тела, в том числе меньшую длину тела, чем у диких животных.
Таким образом, ширмы для морской элегантности. Мутанты размера тела способны идентифицировать бета-сигнальные компоненты и модификаторы TGF для проверки эффективности РНК-интерференции путем кормления для идентификации мутантов размера тела. РНК-интерференция была использована для того, чтобы сбить DBL один компонент пути SMA три на SMA шесть в четырех различных штаммах морской элегантности.
Тестируемые штаммы C elegance включали два штамма RN AI с гиперчувствительностью A one, Lin 15 B и RF 3, а также стандартный штамм дикого типа N 2 и штамм LIN 36, чувствительность РНК-интерференции которого аналогична N два, как показано здесь. Когда экспрессия SMA three или SMA six была нарушена, животные демонстрировали значительно меньший размер тела, чем контрольные животные, за исключением SMA six RNAi в Lin 36. Бэкграунд в РФ три.
Фоновая длина тела молодых людей после лечения РНК-интерференцией составила от 84 до 95% от длины тела только вектора. В A one Lin 15 B фоновая длина тела молодых взрослых особей после РНК-интерференции составила от 68 до 86% от длины тела контрольных животных. Тем не менее, штамм A one lin 15 B дает видовое потомство.
Это делает их непригодными для крупномасштабного досмотра. Поэтому для этих методик рекомендуется использовать три деформации RF. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как идентифицировать гены, регулирующие рост и размер тела, с помощью метода интерференции RNI.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Это видео демонстрирует процедуру использования интерференции РНК (RNAi) для выявления генов, которые регулируют рост и размер тела у C. elegans. Метод позволяет проводить массовое скринирование для выявления генетических компонентов, участвующих в регуляции размера тела через сигнальные пути DBL-1/TGF-β.
This RNAi feeding strategy enables scalable, cost-effective screening for genes regulating body size in C. elegans, supporting target validation in developmental pathways. By linking phenotypic readouts to TGF-β signaling, it provides mechanistic de-risking for early discovery programs focused on growth regulation. The method’s reproducibility and minimal equipment needs make it suitable for academic-industrial collaboration in preclinical target identification.
The method fits within early discovery to lead identification, where genetic hits are prioritized for pathway validation and mechanistic follow-up.