PHluorin изображений с метками рецепторов вставки в плазматическую мембрану в первичной культуре нейронов мыши

Общая цель следующего эксперимента — визуализировать нейронные рецепторы по мере их встраивания в плазматическую мембрану в культивируемых первичных нейронах мыши. Для этого мышиные GL получают из коры головного мозга эмбриональных или неонатальных мышей и выращивают на полупроницаемых культуральных вставках, покрытых коллагеном. Глиальные культуры подвешиваются над первичными эмбриональными нейронами гиппокампа на покровных листках.

Затем, после семи дней кондиционирования, нейроны трансфицируются суперэклиптическим рецептором фтора, меченным дофамином D-2. Меченый рецептор локализуется во внутриклеточных везикулах, но остается нефлуоресцентным в кислой среде везикул. Однако, когда везикула сливается с плазматической мембраной, флорин подвергается воздействию нейтрального pH внеклеточной среды и ярко флуоресцирует, что позволяет обнаруживать его с помощью флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области транспортировки мембранных белков, позволяя нам визуализировать транспортировку любых мембранных белков, которые могут быть помечены фтором, таких как глутаматные рецепторы и рецепторы, сопряженные с gpro. Демонстрируя процедуру вместе со мной сегодня будет разведение сухих, и мы один, два других члена нашей исследовательской группы За день до процедуры вскрытия, Т 75 колбы с раствором коллагена, устанавливаем колбы вертикально и даем им высохнуть в течение ночи. В день культивирования глии прогрейте глиальную среду не менее 30 минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия после эвтаназии, препарируйте кору головного мозга эмбриональных или неонатальных мышей под микроскопом вскрытия.

Поместите удаленные кортикальные мышцы в коническую трубку объемом 15 миллилитров, наполненную льдом, холодом, искусственной спинномозговой жидкостью или спинномозговой жидкостью. Затем удалите все, кроме двух миллилитров спинномозговой жидкости, и добавьте 100 микролитров раствора пепана и 20 микролитров 1% ДНК. Поместите трубку на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия и дайте ткани перевариться в течение 20 минут.

После пищеварения тщательно промойте ткани мозга, осторожно удалив раствор пропана и добавив 10 миллилитров предварительно теплой глиальной среды. Затем следите за тем, чтобы не потревожить ткани. Удалите как можно больше глиальной среды.

Добавьте два миллилитра свежей глиальной среды и с помощью полированного огневкой стекла после пипетки трижды процедите, пока ткань не перестанет быть видна. Избегайте образования пузырьков после того, как ткань полностью диссоциирована. Добавьте еще восемь миллилитров свежей глиальной среды и пипетируйте суспензию через сетчатое фильтр с ячейками 70 микрон.

Соберите поток через 50 миллилитров в коническую трубку. Перенесите диссоциированные клетки от двух до трех эмбрионов в покрытую коллагеном колбу Т 75 и культивируйте при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для тканевых культур на ночь, на следующий день аспирируйте среду. Промойте клетки один раз 10 миллилитрами PBS.

Затем добавьте в каждую колбу от 10 до 15 миллилитров свежей глиальной среды. Инкубируйте культуры в течение 10 – 12 дней, меняя среду каждые три-четыре дня. После слияния промойте глиальные клетки PBS.

Затем добавьте в колбу пять миллиметров 0,05% трипов и дайте ячейкам отсоединиться в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. После короткой инкубации добавьте глиальную среду и пипетку, чтобы отделить GL от дна колбы. Разделите клетки на две новые колбы T 75, покрытые коллагеном.

Как только они достигнут слияния, попробуйте, как и раньше, засейте содержимое каждой колбы в шесть луночных планшетов, содержащих культуральные вкладыши, покрытые коллагеном. Помещают на два миллилитра глиальную среду культуры, клетки на срок от одного до семи дней. Эти вставки для глиальных культур будут использоваться для кондиционирования нейрональных культур.

Добавьте четыре миллилитра гальванической среды в каждую лунку шестилуночной пластины, содержащей очищенные крышки с полилизиновым покрытием, и поместите пластину в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на ночь. Этот шаг увеличивает вероятность выживания нейронов, скорее всего, за счет удаления остаточного полилизина на следующий день. Удалите плоскую среду и замените ее двумя миллилитрами свежей гальванической поверхности.

Среда, содержащая 2% среды. Добавка B 27 для культивирования нейронов гиппокампа Под препарирующим микроскопом препарируйте hippocampi из мозговой ткани четырех эмбриональных мышей типа E 15-18. Поместите бегемота кампи в коническую трубку объемом 15 миллилитров с ледяным буфером для вскрытия.

Затем препарируйте стриатум из мозговой ткани трех эмбриональных мышей Е от 15 до 18 и поместите их в отдельную коническую трубку объемом 15 миллилитров с ледяным буфером для рассечения. Перевариваем ткани с пепаном, как и раньше. Затем с помощью гемоцитометра.

Определите количество клеток в каждой нейронной суспензии и семени. Каждую крышку наносят с 0,4 умножить на 10 на шестую клетку и культивируют их в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. Чтобы приготовить вкладыши для глиальных культур для кондиционирования культур нейронов, аспирируйте среду из вкладышей и планшета для глиальных культур и замените каждый из них двумя миллилитрами свежего покрытия.

На следующий день поместите покровные листы с нейронами в каждую лунку чашки под вкладыши для глиального посева. Продолжайте инкубацию при температуре 37 градусов Цельсия каждые три-четыре дня. Замените половину среды свежей предварительно подогретой средой, содержащей B 27, пока они не будут готовы к трансфекции и экспериментам с визуализацией.

Нейроны будут трансфицированы на седьмой день и визуализированы на восьмой день культивирования. Последовательная культура нейронов является ключом к успешным экспериментам с визуализацией в реальном времени. На этом рисунке показаны нейроны гиппокампа мыши, культивируемые с использованием этого протокола от 11 дней in vitro до 18 дней in vitro.

Из изображений видно, что нейроны развили обширные процессы и что дендритные отростки густо покрыты дендритными шипами. Признаки того, что эти нейроны здоровы в культуре для каждой культуры нейронов. Объединил два микролитра липэктомии в 2001 микрограмме ДНК и кодирует допамин D два рецептора, помеченных суперэклиптикой флорином.

Перемешайте и выдержите 20 минут при комнатной температуре. Во время инкубации извлеките и перенесите один миллилитр среды снизу и один миллилитр изнутри каждой вставки глиальной культуры в ту же коническую трубку. Затем добавьте к сэкономленной среде такой же объем питательной среды с В 27 и инкубируйте при 37 градусах Цельсия.

Эта среда будет использоваться для культивирования нейронов после трансфекции после 20-минутной инкубации ДНК в течение 20 минут. Удалите вкладыши глиальной культуры из шести луночных планшетов. Добавьте 200 микролитров липэктомической ДНК-смеси на каждую покровную пластинку с нейронами.

Избегайте образования пузырьков под мембраной культуры. Замените вкладыши для глиального культивирования и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-четырех часов. После инкубации снова удалите глиальные вкладыши и аспирируйте раствор для трансфекции из каждой лунки, затем добавьте два миллилитра среды, которые ранее были сохранены в нейронах, и замените вкладыши для глиальной культуры.

Наконец, удалите глиальную среду из каждой вставки и добавьте по два миллилитра сохраненной среды в каждую культуру. Клетки в течение дополнительных 24-72 часов, чтобы обеспечить экспрессию трансфицированного CD NA. Система визуализации TIRF, используемая в этом видео, представляет собой специально разработанную систему с 100-милливаттным голубым лазером для возбуждения и камерой устройства с умножающей заряд электронов для детектора за 30 минут до начала визуализации, нагревающей спинномозговую жидкость до 37 градусов Цельсия на водяной бане. Кроме того, включите лазер, камеру и нагревательный вкладыш и поместите нагревательный вкладыш на предметный столик микроскопа.

Поместите покровную крышку с трансфицированными нейронами в камеру для визуализации в реальном времени и быстро добавьте предварительно подогретый ликвор А. Поместите камеру на нагревательную вставку на предметный столик микроскопа в режим эпифлуоресцентной визуализации, идентифицируйте трансфицированные нейроны. Затем в режиме визуализации TIRF фотоотбеливайте нейроны в течение одной минуты, чтобы устранить любую ранее существовавшую флуоресценцию фтора на плазматической мембране.

Затем установите настройку усиления электронного умножителя на камере E-M-C-C-D на максимум и начните съемку в течение одной минуты с частотой 10 герц. Каждая запись будет содержать 600 изображений после того, как все изображения будут завершены. Проанализируйте данные с помощью изображения J, чтобы определить мембранное введение двух рецепторов дофамина D.

Средний шиповидный нейрон мыши был трансфицирован суперэклиптикой. Затем была проведена визуализация дофамина D, помеченного дофамином D, двумя рецепторами PDR D, двумя живыми TIRF-визуализациями, в которой было сделано 600 изображений со скоростью одно изображение каждые 100 миллисекунд. На этом изображении показана проекция максимальной интенсивности покадровой записи, белая стрелка указывает на места, где отдельные везикулы, содержащие pH DD два, срослись с плазматической мембраной.

На этом рисунке показана проекция максимальной интенсивности YT, при которой стек XYT повернут на 90 градусов вокруг оси Y, а максимальный пиксель на каждой линии оси X проецируется на один пиксель оси Y. Эти данные демонстрируют, что этот метод может быть успешно использован для изучения регуляции встраивания рецепторов на плазматической мембране в культивируемых нейронах мышей после ее развития. Этот метод проложил путь исследователям в области транспортировки нейронных рецепторов к изучению регуляции других рецепторов, каналов и транспортеров нейроплазматических мембран.