Количественный анализ Аутофагия использованием Advanced 3D флуоресцентной микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в получении количественных изображений обработанных клеток опухоли предстательной железы для измерения степени и степени аутофагии в разные моменты времени. Это достигается путем первичной обработки клеток аргинином, дазой или другими экспериментальными реагентами, чтобы вызвать аутофагию и/или гибель клеток. Вторым шагом является принятие решения о том, следует ли визуализировать живые клетки или фиксированные клетки, и соответствующая подготовка образцов.

Затем получите 3D-флуоресцентные изображения живых или фиксированных клеток с помощью широкоугольной, деконволюционной или флуоресцентной микроскопии со структурированным освещением. Заключительным этапом является сбор статистических данных о распределении аутофагосом по размерам и колокализации с другими внутриклеточными структурами. Используя программное обеспечение для анализа цифровых 3D-изображений, этот подход может получить результаты, которые показывают не только индукцию аутофага аргинин-дазой может вызвать гибель клеток опухоли предстательной железы, но и то, что эти клетки демонстрируют структурные изменения, которые морфологически отличаются от изменений, связанных с апоптозом и некрозом.

Основное преимущество этой методики перед другими существующими в настоящее время методами заключается в том, что количественная 3D-визуализация может показать, когда и где происходит конкретное молекулярное событие внутри живой клетки, а затем представить его в трехмерном формате. Чтобы начать выращивание клеток рака предстательной железы человека, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок, сопряженная световая цепь три на 35 миллиметровых стеклянных чашках с покрытием из полиде лицина, как описано в текстовом протоколе, клетки должны быть покрыты при достаточной плотности, способствующей быстрой пролиферации, но не настолько, чтобы клетки разрастались и слипались к моменту визуализации. Обработайте выбранные образцы клеток аргинин-дазой или DI в PBS, чтобы истощить клетки свободного аргинина и вызвать метаболический стресс в раковых клетках примерно за час до визуализации, разведите 1,5 микролитра Lyo tracker red с 20 миллилитрами RPMI, содержащим 10% FPS и 1% антибиотиков. Приготовьте растворы с DI для отобранных образцов, которые были обработаны после нагрева всех сред до 37 градусов Цельсия.

Добавьте соответствующую среду в каждую чашку для культивирования, инкубируйте клетки с RPMI, содержащим красный LYO Tracker, в течение 15–45 минут при температуре 37 градусов Цельсия, примерно за 30 минут до визуализации. Включите экологический кожух метеостанции и обеспечьте равновесие до 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа промывочные ячейки с PBS и замените среду на стандартную RPMI, содержащую только 10% FBS и 1% антибиотиков. Добавьте DI к образцам, как указано.

Крепление 35-миллиметрового покровного стекла дна посуды для культуры в индивидуальный адаптер. Используйте иммерсионное масло для объектива с шестью увеличениями DX и числовой апертурой 1,42 и расположите установленную чашку для культуры на предметном столике микроскопа. В этом видео демонстрируется 3D-микроскопия с использованием персонального прикладного микроскопа IDV Delta vision, деконволюционного микроскопа и пакета приложений Associated Soft Works.

Для начала включите микроскопическую систему, включающую в себя рабочую станцию сбора данных и контроллер прибора. Откройте приложение для управления компьютером resolve 3D, чтобы инициализировать предметный столик микроскопа и включить ксеноновый источник света. Подождите 10 минут, чтобы источник света нагрелся и достиг стабильных условий.

Добавьте каплю иммерсионного масла на объектив с числовым увеличением DX и числовой апертурой 1,42 и центрируйте образец предметного стекла со скользящей крышкой лицевой стороной вниз над линзой объектива, используя либо светлопольное, либо внешнее освещение, а также грубую фокусировку. Отрегулируйте ручку, медленно поднимайте линзу объектива до тех пор, пока удары иммерсионного масла не коснутся перевернутого защитного стекла. С этого момента слой ячеек должен оказаться в фокусе в течение нескольких оборотов от ручки точной регулировки фокусировки.

При работе с фиксированными образцами на предметных стеклах рекомендуется избегать ячеек внутри или рядом с любыми областями с пузырьками. При просмотре с живыми образцами на стеклянной нижней чашке избегайте перемещения линзы объектива за границу стекла крышки. Выберите нужное поле зрения.

В идеале клетки должны проявлять хороший флуоресцентный сигнал во всех соответствующих каналах и быть достаточно прикреплены и распределены по поверхности покровного скольжения, чтобы внутриклеточное содержимое было легко визуализировать. Небольшие корректировки боковой фокусировки по осям X, Y и Z могут контролироваться компьютером с помощью интерфейса получения 3D. Установите значение Беннинга один на один или два на два в зависимости от желаемого поля зрения для данного изображения через среднюю часть ячейки, установите параметры экспозиции таким образом, чтобы максимальная интенсивность пикселя не превышала 3000 отсчетов.

Как правило, процент пропускания должен быть установлен на как можно более низком уровне, не увеличивая соответствующую экспозицию. Время более одной секунды. Повторите эту процедуру для каждого цвета флуоресценции, который должен быть изображен, и для каждого отдельного поля зрения.

Чтобы получить изображения наивысшего качества, установите верхний и нижний пределы Zack, слегка отрегулировав фокус над верхней и нижней частями образца клетки соответственно. Таким образом, общее количество изображений в заданном стеке Z будет определяться этими ограничениями и расстоянием между слоями. Чтобы свести к минимуму артефакты движения во время получения изображения, режим получения изображения можно установить на длину волны.

Затем стек ZS для фиксированных сэмплов и стек ZS, затем длина волны для живых сэмплов. После установки всех параметров можно получить флуоресцентные изображения. Флуоресцентные изображения затем девизуются с помощью мягких работ, а затем анализируются с использованием скорости.

Показанная здесь последовательность изображений показывает физические изменения, которые происходят в клетках cwr 22 в течение первых 80 минут индукции аутофагии. На этих изображениях белая пунктирная линия представляет контур клетки, а светлая затененная область представляет положение ядра. В течение 80 минут изображения показывают смещение ядра от центра клетки, уменьшение очаговых точек адгезии и общую транслокацию аутосом и лизосом к центру клетки, которые показаны здесь зеленым и красным цветом соответственно в более поздние временные точки.

Небольшое увеличение колокализации также наблюдалось между аутосомами и лизосомами, на что указывает желтый цвет. Затем для идентификации, подсчета и сбора статистических данных о меченых аутосомах и лизосомах на изображениях клеток CWR 22 был использован пакет приложений для цифровой визуализации. Как показано здесь, количество и размер аутосом после их первоначального формирования при появлении действительно изменяются со временем.

После 80 минут индукции аутофагии наблюдалось постепенное уменьшение количества аутосом с соответствующим увеличением среднего размера аутосом. Кроме того, наблюдалось заметное увеличение колокализации аутосом и лизосом на основе анализа коэффициента корреляции Пирсона. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что при стимуляции аутофагии многочисленные маленькие аутосомы со временем образовывали более крупные аутосомы.

Здесь показано параллельное сравнение изображений, полученных и восстановленных в режиме DV, моделируемой широкопольной деконволюции в сравнении с режимом структурированного освещения. При использовании микроскопа OMX боковое разрешение было увеличено до 120 нанометров, что в два раза превышает разрешение обычной дифракционной ограниченной микроскопии. Мелкомасштабная колокализация аутосом и лизосом была четко очевидна при микроскопии со сверхвысоким разрешением, в то время как при обычной флуоресцентной визуализации она была едва заметна.

Одним из преимуществ использования деконволюционной микроскопии является возможность реконструкции всех изображений в 3D-модель, которая позволит получить более точную пространственную информацию между различными молекулами. Здесь показана общая картина аутофагии одной клетки Cwr 22 RV в более поздний момент времени, когда начинает происходить значительная колокализация между аутосомами и лизосомами. Когерентное окрашивание, обозначенное белым цветом, показывает контур целевой клетки в этом фильме.

3D-реконструированная модель предоставляет больше пространственных деталей слияния между аутосомами и лизосомами. Как показано желтым цветом, взаимодействие между сигналами третьей цепи зеленого света и красными сигналами лизосом очевидно в присутствии объединенных сигналов с образованием желтого цвета. Таким образом, этот подход решит две основные проблемы для исследователей, изучающих аутофагию.

Прежде всего, мы хотим сохранить свободную от стресса среду, используя микрожидкость, камеру изобилия, чтобы поддерживать ее первоначальное физиологическое состояние на предметных столиках микроскопа. Вторая задача заключается в сборе статистически значимых количественных данных изображений, и для фиксированных клеток мы обычно берем много изображений из разных клеток и компилируем их в полезную информацию. Однако в случае с жизненной клеткой мы просто следуем за одной клеткой с течением времени, чтобы получить эквивалентную информацию.

Поэтому мы считаем, что этот метод позволит другим исследователям изучить функцию и роль аутофагии в различных органах и различных заболеваниях.