Клиническое применение

Этот протокол генетически модифицирует Т-клетки для введения химерных антигенных рецепторов, специфичных для опухолевых антигенов, а затем распространяет клинически значимые цифры на дизайнерских искусственных антигенпрезентирующих клетках. Начните с электропереноса спящей красавицы. Транспонировать и транспонировать плазмиды ДНК А в пассивные мононуклеарные клетки, выделенные из периферической или пуповинной крови.

Затем измерьте эффективность трансфекции с помощью проточной цитометрии. Затем совместное культивирование трансфицированных Т-клеток в течение семи дней на K 5 62 полученных искусственных антигенпрезентирующих клетках с добавлением экзогенных цитокинов в течение четырех недель стимуляции. Циклы пролиферации продолжаются для анализа криоконсерва и высвобождения электропорированных и размноженных автоположительных Т-клеток для применения человеком.

Система транспонирования спящей красавицы предлагает альтернативу вирусным подходам к переносу генов для стабильного внедрения гена в выбранную клетку. Одним из главных преимуществ системы «спящая красавица» является то, что можно интегрировать гены с меньшими затратами по сравнению с ДНК-плазмидами, которые интегрируются посредством незаконной негомологичной рекомбинации. Таким образом, преимущество заключается в том, что система спящей красавицы может быть использована для экспрессии гена с низкими затратами и высокой эффективностью.

Как правило, людям, не знакомым с этим методом, первоначально придется преодолеть эффективность электроТ-клеток в селективном распространении автоположительных Т-клеток на искусственных антигенпрезентирующих клетках. Оба шага сложны для освоения из-за необходимости сокультуры. Генетически модифицированные Т-клетки на искусственных антигенпрезентирующих клетках.

Этот метод полезен в области адоптивной иммунотерапии, в частности, для эффективной доставки генов и производства клинически значимого количества Т-клеток. Более широкое применение распространяется на терапию рака, потому что Т-клетки иммунной системы могут быть модифицированы для специфичности опухоли. Демонстрировать процедуру будут Маргарет Доусон и Мэтью Фиола.

Техники из моей лаборатории: сначала разбавляют периферическую кровь равным объемом P-B-S-E-D-T-A и пуповинную кровь четырьмя объемами P-B-S-E-D-T-A медленно наливают 25 миллилитров разбавленной крови на 12 миллилитров флакала в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте градиент фиала при давлении 400 G в течение 30–40 минут без перерыва. Теперь переложите фракцию мононуклеарной ячейки в свежую 50-миллилитровую центрифужную пробирку с P-B-S-E-D-T-A.

Доведите объем до 50 миллилитров и соберите клетки методом центрифугирования. Аккуратно промойте клетки один раз в 50 миллилитрах готовой культуры, среды и центрифугируйте при 400 G в течение 10 минут. Затем объедините клеточные гранулы в CCM, выполните подсчет клеток.

Использование метода исключения триамного синего. Мононуклеарные элементы теперь могут быть использованы для электропорации или криоконсервированы для использования в будущем. При использовании криоконсервированных ТНК быстро разморозьте два раза по 10 до восьмой ячейки для полномасштабной электропорации, аккуратно перенесите ячейки в центрифужную пробирку соответствующего размера, содержащую предварительный подогрев.

Полные питательные среды RPMI без фенола и гранулирование клеток методом центрифугирования ресуспендируют мононуклеарные клетки в P-F-R-P-M-I проводят подсчет клеток и переносят клетки в сосуд для клеточной культуры соответствующего размера в концентрации 10 из шести клеток на миллилитр. Уравновесьте клетки во влажном инкубаторе в течение двух часов. Соберите ТНК центрифугированием, затем аккуратно ресуспендируйте и соедините клеточные гранулы в P-F-R-P-M-I и перечислите ячейки Теперь переложите два раза по 10 до восьмого МНК в стерильную 50-миллилитровую центрифугу и центрифугируйте при давлении 200 G на 10 минут без перерывов.

Аспирируйте надосадочную жидкость так, чтобы вокруг клеточной гранулы не оставалось остаточной среды. Приготовьте стерильную 12-луночную пластину с 10 лунками, содержащую четыре миллилитра теплого P-F-R-P-M-I и уравновесьте пластину во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Затем восстановите раствор эффектора Lonzo Nucleo из набора Т-клеток человека в соответствии с инструкциями производителя для каждой реакции.

Q Vet приготовьте 100 микролитров мастер-смеси ДНК, содержащей добавленный раствор ядерного эффектора NU. 15 микрограмм транспонирования на плазмиду и пять микрограммов транспонированной плазмиды. Затем диспергируйте гранулы Т-клеток и ресуспендируйте NU раствор ядерного поражения мастер-смеси ДНК при конечной концентрации клеток в два раза больше 10-й седьмой клетки на 100 микролитров.

Осторожно перенесите по 100 микролитров клеточной суспензии в каждую из 10 кювет для поражения ядра lonza, стараясь не допустить образования пузырьков. Теперь нажмите на qve один раз и включите электро с помощью программы U 0 1 4 для нестимулированных Т-клеток. Перенесите кюветы и уравновешивающий 12-луночный планшет в культуральный колпак с помощью дозатора с тонким наконечником переносной пипетки в дозе 500 микролитров предварительно прогретой питательной среды из соответствующей лунки в каждую вету.

Перенесите электропорированные клетки в планшет и дайте клеткам восстановиться в инкубаторе для клеточных культур в течение двух часов. Затем перенесите клетки из всех лунок в стерильную центрифужную трубку и гранулируйте клетки после одной промывки, аккуратно диспергируйте клеточную гранулу и восстановите суспендию в CCM для получения суспензии за одну клетку. После подсчета клеток отрегулируйте концентрацию клеток так, чтобы она соответствовала шести клеткам на миллилитр в КМК.

Затем перенесите клеточную суспензию в колбу для культур и поместите в инкубатор на ночь для получения трансфицированных клеток EGFP. Повторите протокол электропорации, используя пять раз по 10 из шести клеток на вету с пятью микрограммами плазмиды EGFP, контролирующей амокс. Соберите электропорированные клетки, затем выполните подсчет клеток с помощью метода исключения триенского синего.

Затем окрасьте один-два раза в 10 из шести клеток антителами, специфичными для CD 3, CD 4, CD 8 и гамма IgG FC человека в качестве измерения экспрессии автомобиля. Приобретайте ячейки на факсе калибра. Анализируйте данные с помощью экспресс-программы FCS для определения экспрессии автомобиля.

Затем подсчитайте автоположительные клетки в культуре. Клон A PC номер четыре будет производиться от K 5 62 клеток для совместной экспрессии желаемых Т-клеточных костимулирующих молекул Разморозьте аликвоту замороженных облученных A A PC в водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Затем промывайте клетки и КМК подсчитывают жизнеспособные клетки с помощью синего исключения и рассчитывают количество жизнеспособных ПК, необходимых для стимуляции.

Смешайте электропорированные клетки, экспрессирующие car и гамма-облученный A A PC, в стерильном контейнере в соотношении один к двум. Отрегулируйте соотношение A PC для экспрессии car на основе проточной цитометрии на следующий день после электропорации: добавьте в клеточную суспензию 30 нанограмм на миллилитр IL 21. Затем Eloqua обрабатывал шесть клеток на миллилитр в колбах с Т-75 или просматривал пакеты с культурами жизни и возвращался в инкубатор для культур, осуществлял электроперенос ДНК-плазмид и размножение Т-клеток на гамма-облучении.

ПК может быть использован для получения клинически привлекательного количества Т-клеток, полученных из периферической крови и пуповинной крови, для применения у человека. В данной характеристике генетически модифицированных Т-клеток из экспрессии EGFP в периферической крови в нулевой день первого цикла стимуляции эффективность экспрессии переноса генов специфического автомобиля CD 19 оценивается с помощью проточной цитометрии на CD 3 положительных, CD 8 положительных и CD 4 положительных Т-клеток примерно через 24 часа после электропорации. А затем, через 28 дней после совместного культивирования на А ПК кинетики экспрессии автомобиля на Т-клетках, выращенных в функционально закрытой системе.

Размножение автоположительных Т-клеток, полученных из периферической крови, с течением времени может привести к образованию клинически привлекательного количества Т-клеток, которые стабильно экспрессируют автомобиль. После четырех недель совместного культивирования на A A PC среднее кратное увеличение CD трех положительных Т-клеток составляет около 19 800 с 90% экспрессией CAR. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как правильно выбирать парадные и размножать Т-клетки, выражающие желаемый автомобиль.

Не забывайте следить за чрезмерным ростом NK-клеток. Электропорация и размножение Т-клеток обычно осуществляется в течение четырех семидневных циклов стимуляции. Дальнейшие исследования, такие как анализ высвобождения цитокинов и цитотоксичности, могут быть проведены для оценки перенаправленной специфичности генетически модифицированных Т-клеток в области адоптивной иммунотерапии.

Этот метод помогает нам понять терапевтический потенциал Т-клеток, которые вводятся в организм человека.