Молекулярная визуализация на цель трансплантированных клеток-предшественников мышц

Общая цель этой процедуры заключается в неинвазивной оценке успешности трансплантации миобласта с использованием репортерного генного подхода и биолюминесцентной визуализации. Это достигается путем первого введения гена, о котором сообщается о tri fusion, который экспрессирует f Luke, MRFP и SR three 90 tk под контролем промотора CMV, в иммортализованную клеточную линию C two C 12 myoblast. Вторым шагом является количественная оценка количества миобластов, экспрессирующих ген портера.

В данном исследовании эффективность трансфекции рассчитывается путем подсчета экспрессирующих MRFP клеток на флуоресцентном микроскопе. Затем от 10 до пяти сконструированных клеток в объеме, равном или менее 15 микролитров, имплантируются внутримышечно в заднюю конечность мышей с дистрофией MDX. Трансфицированные клетки ЕНТ имплантируются в контралатеральную заднюю конечность в качестве контроля, затем проводится базовое сканирование.

Заключительным этапом является внутрибрюшинное введение, введение субстрата гена, о котором сообщил Люк, Люцифер после периода поглощения около 20 минут, проведение второго биолюминесцентного сканирования для получения изображения имплантированных клеток. В конечном счете, поглощение Люцифера наблюдается специфически в клетках, экспрессирующих f Luke, без обнаруживаемой биолюминесценции в контрольных клетках, которые не экспрессируют ген отчета. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области технологии переноса мягких потерь, такие как миграция клеток после имплантации, а также выживание клеток после трансплантации.

Применение этого метода распространяется на терапию мышечных заболеваний, таких как мышечная дистрофия Дюшенна, потому что это быстрое и надежное средство неинвазивного нацеливания на клетки. Таким образом, после трансплантации мы можем оценить приживленную область с течением времени и оценить успех или неудачу лечения. Демонстрацию процедуры будут проводить аспирантка Келли Гут Пе и техник-исследователь из нашей лаборатории Ребекка Макг, извините, Культура С два миобласта C 12 в модифицированной среде с высоким содержанием глюкозы dcos с 10% фетальной бычьей сывороткой в соответствии со стандартными процедурами для этой клеточной линии. Не позволяйте клеткам сливаться более чем на 80%, так как это приведет к истощению популяции миотов.

Чтобы подготовить клетки к трансфекции, сначала соберите клетки из бульона, кратковременно покрыв слой клеток промывки HBSS трипсином. Затем быстро отсасывают трипсин и помещают колбу в инкубатор для культуры тканей на пять минут. Во время инкубации приготовьте две колбы Т 75, каждая из которых содержит девять миллилитров питательной среды.

Когда время инкубации закончится, добавьте в колбу 10 миллилитров среды и промойте среду на дне колбы четыре-пять раз, чтобы обеспечить сбор всех клеток. Затем засейте каждую из колб Т 75 одной 10-й частью клеточной суспензии из запасной колбы Т 75. При первой попытке проведения этой процедуры проведите анализ МТТ, чтобы оценить влияние мечения клеток на выживаемость и дифференцировку клеток, а также жизнеспособность сконструированных миобластов до трансплантации.

Как только клетки достигнут 50% конфлюенции, трансфектируйте одну колбу T 75 36 микрограммами репортерного гена слияния CMV Tri в оптимальном объеме 4,5 миллилитра, используя липофектамин 2000 в соответствии с инструкциями производителя. Кроме того, выполнить имитацию трансфекции второй колбы T 75 с использованием только lipo 2000 и оптимально без ДНК в качестве отрицательного контроля. Дайте клеткам трансфектировать в течение не менее 20 часов при температуре 37 градусов Цельсия на следующий день, аспирируйте трансфекционную среду и замените ее подходящим объемом питательной среды с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа.

Захватывайте как светлопольные, так и красные флуоресцентные изображения, чтобы рассчитать эффективность трансфекции. После забора трансфицированного миобласта трипсином и суспензией клеток в четырех миллилитрах полной среды, используйте гемоцитометр для подсчета клеток. Пипетка от 10 до шести клеток в стерильную микропробирку объемом 1,5 миллилитра с эффективностью трансфекции около 10%. Это количество клеток должно дать начало 100 000 обнаруживаемых решеток Люцифера, экспрессирующих клетки, после трансплантации окончательный объем инъекции должен составлять 15 микролитров.

Если объем в пробирке больше этого, то центрифугируйте микропробирки при 2000 об/мин в течение одной минуты, намочите супинат, а затем согните реус в максимальном объеме 15 микролитров роста. Среда с недостаточным FBS После индуцирования анестезии у мышей с использованием 2%изофтора переключитесь на 1,5%изофтора для поддержания анестезии. Во время процедуры поместите мышь в положение лежа и выщипывайте шерсть из области спинной задней конечности.

Убедитесь, что С-2 С-12 миобласты хорошо суспензированы, а затем загрузите клеточную суспензию в инсулиновый шприц. Введите клетки непосредственно в боковую головку желудочно-кишечной мышцы под углом 30 градусов. После введения трансфицированных миобластов в правую заднюю конечность повторите процедуру с трансфицированными ЕНТ миобластами в контралатеральную заднюю конечность.

Выполните базовое биолюминесцентное сканирование. Один человек должен быстро перенести мышь на сцену в оптический сканер, уложив мышь в положение лежа. Второй человек одновременно подключает анестетик, чтобы обеспечить обезболивание мыши.

Аккуратно вытяните задние конечности и с помощью медицинской ленты удерживайте конечность на месте, чтобы были видны обе области инъекции. Закройте камеру и убедитесь, что свет не проникает внутрь сканера, так как это усилит обнаруженный фоновый сигнал. Сканер должен быть настроен на параметры, включенные в инструкцию производителя по биолюминесцентной визуализации.

Нарисуйте область интереса вокруг вырванной области инъекции и запустите сканирование, чтобы получить исходное изображение, пока мышь находится под наркозом. Внутрибрюшинный. Введите 150 мг на килограмм субстрата люциферазы светлячка Люцифераза в. Поместите мышь в чистую клетку и дайте ей восстановиться после анестезии.

Подождите 15 минут, прежде чем подготовить мышь к следующему сканированию. После 15-минутного периода адаптации. Обезболите мышь и перенесите на сканер, как и раньше.

Выполните повторное люминесцентное сканирование таким же образом, как и фоновое сканирование. Общий период захвата в 20 минут должен обеспечивать максимальную интенсивность сигнала, но при желании может быть выполнено последующее сканирование. На этой схеме показана конструкция репортера CMV Tri Fusion.

На левой панели показано яркое изображение двух миобластов C 12, трансфицированных плазмидой термоядерного репортера, а на правой панели показана та же область, что и флуоресцентное изображение, как показано здесь. Область интереса рисуется, чтобы охватить область выщипанной задней конечности, в которую были введены миобласты. Биолюминесценция не обнаруживается при фоновом сканировании.

Через 23 минуты после инъекции люцифериана обнаруживается четкий сигнал из правой задней конечности, куда были введены миобласты, экспрессирующие люциферазу. Биолюминесценция в контралатеральной задней конечности, в которую вводили нерезецированные миобласты, как видно, не обнаруживается. Здесь иммуногистохимический анализ с использованием антитела к люциферазе светлячка подтверждает внутримышечную имплантацию трансфицированных клеток С-2-2 С-12.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить об использовании асептических методов культивирования тканей и соответствующих методов обращения с животными после ее разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области мышечных заболеваний к изучению эффективности клеточной терапии на доклинических моделях заболевания на мелких животных. Затем, позже, в клинических условиях у пациентов, после просмотра этого видео, у вас должно быть хорошее понимание того, как имплантировать клетки и как неинвазивно локализовать сконструированные трансплантированные миобласты с помощью биолюминесцентной визуализации.