Новорожденных субвентрикулярной Electroporation зоны

Целью этой процедуры является генетическая маркировка и манипулирование молекулярными составляющими нейростволовых клеток субжелудочковой зоны. Это достигается путем введения стеклянной пипетки, загруженной ДНК, в латеральный желудочек P нулевого P. Вторым шагом является выталкивание ДНК в спинномозговую жидкость бокового желудочка. Следующий ток подается на P. Это позволяет осуществлять перенос ДНК к нейральным стволовым клеткам, выстилающим боковые желудочки.

В конечном счете, комбинация молекулярных методов, включая иммуногистохимию, молекулярную биологию, микроскопию и электрофизиологию, используется для визуализации изменений в судьбе, пролиферации, миграции и созревании нейростволовых клеток субвентрикулярной зоны. Электропорация поджелудочковой зоны новорожденных может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейрогенеза, например, какие молекулярные пути отвечают за регулирование пролиферации, дифференцировки, миграции и созревания нейрональных стволовых клеток и их потомства. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как трансгенные мыши, заключается в том, что он позволяет быстро и надежно мечить нейронные стволовые клетки SVZ эффективным по времени и с минимальными затратами способом.

Во-первых, убедитесь, что ДНК для электроочистки имеет высокую чистоту и концентрацию и не содержит эндотоксинов. Вытащите 10-сантиметровые капиллярные трубки из кварцевого стекла BO с огненной полировкой в пипетки. Здесь используется съемник пипеток PP eight 30 ghhi PC 10, предназначенный для вытягивания одноступенчатой утяжеленной тяги при температуре 70,5 градусов Цельсия После вытягивания пипетки с помощью круговых щипцов сломайте наконечник.

Затем осмотрите пипетку под препарирующим микроскопом, чтобы убедиться в отсутствии зазубренных краев. При необходимости наконечник можно скосить с помощью точильного камня. Далее поместите налитые пипетки под ультрафиолетовую лампу на 15 минут.

По истечении 15 минут отметьте пипетку на расстоянии двух миллиметров от края наконечника тонким маркером для наконечника. Наконец, приготовьте быстрый зеленый раствор в соотношении 0,1 веса на объем, смешав стерильный фильтрованный 0,9% стерильный физиологический раствор с сухим быстрым зеленым обезболиванием. Щенок в возрасте от нуля до одного дня в стеклянной чашке Петри предварительно охлаждается до четырех градусов Цельсия и помещается на западный лед Примерно через пять минут определите состояние анестезии, используя реакцию на щипывание ноги.

Если движения не происходит, начните внутрижелудочковую инъекцию. Соедините быстрый зеленый раствор с раствором ДНК и нанесите один или два микролитра на биопленку. Важно, чтобы это было сделано непосредственно перед введением, так как сочетание быстрого зеленого раствора с ДНК может привести к быстрому испарению и кристаллизации с последующей блокировкой стеклянных пипеток, аспирировать весь объем аликвоты с помощью шприца с микропленкой и загрузить стеклянную пипетку на инжектор под воздушным давлением.

Теперь осторожно возьмитесь и удерживайте голову щенка между большим и указательным пальцами последней доминирующей руки. Затем включите лампу и держите голову щенка прямо за пределами светового луча. Если желудочки не видны четко, увлажните голову стерильным физиологическим раствором, чтобы уменьшить количество света, отраженного кожей головы.

Далее доминирующей рукой введите иглу в ближний боковой боковой желудочек. Место инъекции должно быть примерно равноудалено от шва OID и глаза, и на два миллиметра латеральнее сагиттального шва. Вставьте вытянутую пипетку на отметку в два миллиметра для нулевого щелчка P, который должен обеспечить проникновение в боковой желудочек.

Обратное заполнение спинномозговой жидкости в пипетку может происходить из-за сброса внутричерепного давления. Если это произошло, ослабьте хватку на головке СОЗ, чтобы снизить давление и помочь во введении плазмиды. После того, как пипетка будет введена оптимально, введите примерно 0,5 микролитра плазмиды в боковой желудочек.

Установите напряжение электрогенератора для пяти квадратных импульсов, 50 миллисекунд на импульс и 100 вольт с интервалом 50 миллисекунд. Пространственная специфичность работы плазменного электропита определяется направлением переноса заряда, поэтому пространственное рассмотрение следует уделять размещению электродов с учетом того, насколько разнообразны ячейки СВЗ. Люди сообщали об изменениях с точки зрения судьбы клеток и пролиферации в вентральном дорсальном направлении до мест расположения CAU.

После введения плазмидного погружения пинцетные электроды в PBS для максимального переноса заряда и предотвращения ожогов, вызванных удельным сопротивлением. Далее поместите положительный электрод на дорсальную боковую стенку черепа возле уха и опустите боковую инъекцию к цитоплазме. Затем поместите отрицательный электрод на контралатеральную полусферу вентрально латерально к поп-рылу.

На этом рисунке показана правильная ориентация отрицательных и положительных электродов по отношению к оси x, y, Z на инъецируемом щенке. Инициируйте передачу тока, нажимая педаль импульсного ножного переключателя, и поворачивайте электроды от дорсального к боковому, используя интервалы под углом около 25 градусов. После завершения электропорации поместите всех щенков на грелку на пять минут.

Осторожно вращайте щенков каждые 30 секунд с легкой стимуляцией. На этом изображении показан боковой желудочек неонатальной мыши через 24 часа после электропорации вектора, кодирующего EGFP. Электроэлементы с электрическим рейтингом флуоресцируют зеленым цветом.

Здесь мы видим, что латеральный желудочек меченый ЛЖ через 28 дней после электропорации Cree Recombinase и GFP, кодирующий плазмиды у мышей, несущий стоп-код на входе TD томата, рекомбинация индуцирует экспрессию TD томата, видимую красным цветом, последовательное разведение плазмиды приводит к небольшому количеству оставшихся EGFP-положительных клеток SVZ или геномно экспрессируемый TD томат постоянно экспрессируется. Разведение плазмиды, ДНК, показанной зеленым цветом, очевидно, учитывая, что большее количество клеток в гранулярном слое обонятельной луковицы, помеченной OB, экспрессировало геномный маркер томата TD, показанный красным цветом. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как маркировать и манипулировать стволовыми клетками из SVZ.