Мышиные Spinotrapezius модели для оценки воздействия артериол Лигирование на микрососудистой функции и ремоделирования

Заболевания периферических сосудов поражают примерно от 12 до 14% населения и особенно распространены среди потребителей табака и людей с диабетом, ожирением, гипертонией, поздней стадией или атеросклерозом. Целью этой операции является создание модели ишемии скелетных мышц путем перевязки одной из трех питающих артерий к пятнистой половине зеркальной трапециевидной мышцы. Эта анимация изображает генерализованное расположение этих артерий и указывает предполагаемое место лигирования в ответ на ишемию.

Сосудистая ткань претерпевает изменения, характерные для агенезии артерий, в зависимости от штамма мыши. Это включает в себя образование мостиковых коллатералей или увеличение извитости судна. Мы также покажем вам, как провести процедуру функциональной вазодилатации трапециевидного позвоночника с помощью интрациевидной микроскопии.

Это включает в себя тщательное воздействие на мышцу, размещение стимулирующих электродов с их источником питания и контроллером, а затем настройку устройства визуализации. Наконец, мы покажем, как иссекать мышцу, и опишем процесс фиксации, подходящий для иммунохимического окрашивания и визуализации. Здравствуйте, меня зовут Шейн Пирс Котлер, и я доцент кафедры биомедицинской инженерии в Университете Вирджинии в Шарлоттсвилле.

Привет, меня зовут Кайл Мартин. Я учусь в аспирантуре в лаборатории Шейна и буду работать на модели трапециевидного лигирования позвоночника. Наша лаборатория изучает рост и ремоделирование микрососудов, особенно в условиях ишемической болезни, такой как болезни сердца, заболевания периферических артерий и инсульт.

Мы разработали эту зеркальную модель трапециевидного лигирования позвоночника для изучения того, как локализованная обструкция артериального кровотока создает структурные адаптации в нисходящих микрососудистых сетях. Мы рассматриваем эту модель как дополнение к хорошо зарекомендовавшей себя и широко используемой модели ишемии задних конечностей в том смысле, что она предлагает целостный сетевой взгляд на артерию, нейрогенез и ангиогенез в очень тонкой мышце, которая не требует гистологического среза для анализа. Поскольку эта мышца очень тонкая и поскольку лигирование создает воспроизводимое снижение кровотока, мы можем визуализировать эффекты артериального лигирования по всему микрососудистому руслу и с разрешением одной клетки.

После того, как Кайл проведет нас через пошаговую процедуру выполнения модели трапециевидного лигирования, наши сотрудники из Cal Poly покажут нам, как они используют эту модель для изучения функциональной вазодилатации. Как только мы это увидим, мы вернемся в Университет Вирджинии и возьмем материал из трапециевидного хребта, что необходимо сделать перед визуализацией и окрашиванием. Здравствуйте, меня зовут Тревор Кардинал.

Я доцент кафедры биомедицинской инженерии в Калифорнийском политехническом государственном университете в Сан-Луис-Обиспо, штат Калифорния, и меня зовут Джош Катц. Я учусь в магистратуре по биомедицинской инженерии в Калифорнийском политехническом университете в Сан-Луис-Обиспо. Основной интерес нашей исследовательской лаборатории заключается в понимании влияния хронической ишемии, возникающей при заболевании периферических ВА, на функциональные возможности сосудистой сети резистентности.

Таким образом, после проведения операции по перевязке трапециевидной артерии позвоночника, Джош продемонстрирует процедуру функциональной вазодилатации, используемую в нашей лаборатории. В нашей лаборатории мы используем процедуру функциональной вазодилатации для изучения влияния артериальной окклюзии на сосудистую реактивность и инструменты для контроля кровотока. Для предварительного приготовления возьмите с собой 10-узловой шовный материал, О-образный закрывающий шов, иглодержатель, ножницы для радужной оболочки, стандартные щипцы, пружинные ножницы и изогнутый микрозонд.

После подготовки хирургических инструментов обезболиваем мышь, здесь же используем отображение формулы и дозировки. Подтвердите обезболивание пальцем ноги, ущипните тест на рефлекс, затем нанесите защитный IGEL с помощью электрической бритвы на большой участок шерсти со спины животного. Несмотря на то, что для перевязки трапециевидного позвоночника требуется только небольшая область вокруг лопатки, забор трапециевидной ткани позвоночника, который должен быть выполнен в течение нескольких дней, потребует гораздо большей очищенной поверхности.

В спешке уберите лишнюю шерсть, затем нанесите крем для удаления волос, следуя инструкциям производителя. Вымойте заднюю часть влажной губкой. Затем нанесите три набора чередующихся спиртовых салфеток Бетадин, заканчивающихся Бетадином одином.

При хорошем освещении наилучшее место разреза может быть найдено путем трансдермальной идентификации спинного жирового пакета. Поскольку питающая артерия в конечном итоге проходит через трапециевидную мышцу позвоночника резко, опушенный жировой мешок окаймляет кожу в этом месте и вводит ножницы радужной оболочки прямо сверху перпендикулярно тыльной стороне животного и разрезает, чтобы сделать линейный разрез от трех до пяти миллиметров. Если освещение или пигментация кожи не позволяют провести трансдермальную идентификацию.

Поместите разрез на пять миллиметров до костного выступа лопатки, продлите разрез через слои кожи и расширяйте по мере необходимости, чтобы найти трапециевидный позвоночник. Рассеките вышележащую фасцию, чтобы получить доступ к месту перевязки. Если поверхностный сосуд поврежден и кровоизлияния, как в этом случае, дайте время остановить кровотечение и при необходимости надавите, используйте физиологический раствор для предотвращения высыхания.

Указанная артерия лежит вдоль дорсальной стороны трапециевидного позвоночника, а затем пересекает мышцу и входит в вентральный жировой пакет. Найдите боковой край трапециевидного хребта и отразите его, приподняв его так, чтобы он был почти перевернут. Это обнажает его вентральный вид, а поперечный участок артерии рассекает вентральную жировую подушку, которая закрывает сосуд.

Будьте осторожны с давлением щипцов, чтобы избежать раздавливания. Здесь хирург указывает на перевязку трапециевидной артерии. Обратите внимание на наличие у пар вен вазодилататора, такого как аденозин более короткого действия, или папин более длительного действия, может быть применен.

В этом случае артерия лежит между двумя другими сосудами, как указано стрелками. Одна из них похожа по размеру на артерию и может лежать более латерально, если бы мышца не отражалась, в то время как другая намного больше и лежала бы более непосредственно. Два участка лигирования помечены буквой ai.

Первая лигатура размещается в нисходящем направлении относительно второй. Это гарантирует, что сосуд все еще наполнен кровью и виден во время установки второй лигатуры. A обозначает область, которую необходимо пересечь.

Обратите внимание на место В, где артерия и ее парная вена входят в вентральный жировой пакет, очерченный С. Это дает нам понять, что второй меньший сосуд является веной. Также обратите внимание на саму трапециевидную мышцу позвоночника, очерченную D. Несколько указаний для различения артерии от вены приведены в сопроводительном текстовом протоколе. Но вкратце, наш предпочтительный метод заключается в препятствовании кровотоку путем давления с помощью микрозонда.

Если сосуд является артерией, то поток будет затруднен в нисходящем направлении к приложению отраженной мышцы. Данный метод исключает более крупное судно. При необходимости используйте микрозонд, изогнутый на 80 градусов, чтобы отделить артерию от других сосудов.

Это делается путем прокалывания соединительной ткани под сосудом и совершения коротких боковых движений для расширения щели. До тех пор, пока зонд не будет легко пропущен через шовный материал, игла может быть легче продета под артерию. В этом случае была порезана небольшая вена, вызвавшая незначительное кровотечение.

Этот сосуд находится достаточно далеко от ишемизированной зоны, чтобы оказывать минимальное воздействие. На процедуре завяжите один хирургический узел и подготовьте следующий шов. Опять же, проходя через заранее сделанный зазор и завязывая еще один хирургический узел в нескольких миллиметрах вверх по течению от предыдущей лигатуры.

Имейте в виду, что мышца отражается, и направление потока может быть противоположным ожидаемому. После того, как обе лигатуры были установлены, ищите признаки обструкции столба эритроцитов. Если поток не был остановлен, необходима еще одна лигатура.

В противном случае пересекают сосуд между лигатурами, отмечая, если происходит кровотечение, в этом случае перевязка прошла успешно и артериального кровотечения не наблюдается. Альтернативный метод использует одну лигатуру и пересечение в нисходящем направлении. Ознакомьтесь с сопроводительной литературой, чтобы узнать, когда этот метод является предпочтительным.

Восстановите мышцу в исходное положение, переместите смещенную жировую ткань и фасцию и закройте нерассасывающимся швом. Наконец, поместите мышь в отапливаемую клетку для восстановления под наблюдением и обезболивающим средством для спинотрапециевидной внутрижизненной микроскопии. Мышь сначала обезболивают изофтором в индукционной камере, а затем подключают к непрерывному потоку изофтора через носовой конус.

Вставьте ректальный температурный зонд и установите терморегулятор на 35 градусов Цельсия Заранее подготовьте инструменты, включая ножницы для радужной оболочки, стандартные щипцы, пружинные ножницы и увлажненный тампон PBS. Сделайте разрез кожи на зубчатом конце трапециевидного позвоночника с помощью ножниц для радужки глаза и стандартных патентованных щипцов. Продлите разрез черепно до жировой подушки, создав разрез в виде подковы, и накройте кожный лоскут полиэтиленовой пленкой, чтобы предотвратить тупое высыхание, рассеките подкожную соединительную ткань тонкими щипцами для максимальной видимости.

Поместите стимулирующие электроды, держа их как можно ближе друг к другу, чтобы свести к минимуму размер поля тока, расположите их на коленчатом конце обнаженной мышцы сбоку от позвоночника. Встаньте на якорь с помощью пластилина. Выполните тестовую стимуляцию для подтверждения расположения электродов с помощью системы сбора данных Power Lab, стимула, изолятора и программного обеспечения для лабораторных диаграмм, настроенного на прямоугольные волны длительностью 200 микросекунд, амплитудой два миллиампера и подачей с частотой в один герц.

Снова накройте обнаженную мышцу полиэтиленовой пленкой. Чтобы избежать высыхания, подождите 30 минут на каждый диаметр сосуда для выравнивания, а затем сделайте снимок или видеосъемку. Расположите прижизненный микроскоп над трапециевидной мышцей позвоночника, чтобы рассмотреть архитектуру сосудистой сети.

Если вы используете иммерсионную линзу, поместите каплю PBS между объективом и полиэтиленовой пленкой, начиная с основной артерии, которая является самым большим видимым сосудом. Манипулируйте сценой в плоскости XY, чтобы найти интересующее судно. Стимулируйте мышцу прямоугольными волнами предыдущей продолжительности и амплитуды, но с частотой восемь герц и в течение 90 секунд сразу после стимуляции.

Визуализируйте сосуд и продолжайте делать это каждую минуту, пока он не вернется к диаметру покоя. Анализ данных может быть выполнен в режиме реального времени с помощью видеоштангенциркуля или в автономном режиме с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Повторите процедуру от первоначального разреза до визуализации с использованием контралатеральной мышцы.

Когда закончите. Усыпьте мышь в соответствии со стандартным протоколом CUC для забора ткани из расщелины позвоночника. Нам понадобятся ножницы для радужной оболочки глаза, стандартные щипцы и пружинные ножницы.

Обезболите мышь, как описано выше. Начните с того, что сделайте разрез на несколько миллиметров краниально к лопатке мыши. Расширьте разрез сбоку, а затем обмажьте с обеих сторон.

Цель состоит в том, чтобы обнажить трапециевидную мышцу позвоночника, которая после разреза простирается от T 3 до L 4. Кожа может быть отделена от спины путем осторожного вытягивания или осторожного разрезания соединительной ткани, удерживая ее на месте, супер сросшейся с солевым раствором для предотвращения высыхания и помощи в работе с тканями. Используйте тупое рассечение, чтобы удалить дорсальную жировую ткань и обнажить трапециевидную мышцу позвоночника.

Аналогичным образом удаляют вентральную жировую ткань. После отражения мышцы здесь идентифицируется правосторонний позвоночник животного t-trapezius. Затем удалите как можно больше вышележащей фасции.

Эта часть процедуры может быть утомительной, но не менее важной для предотвращения артефактов во время микроскопии. После того, как соединительная ткань была удалена, иссекаем ткань, как показано на рисунке, сначала разрезая боковой край примерно параллельно тыльной стороне и двигаясь в направлении краниала к нянчке. Затем разрежьте поперечно по крайней части черепа и, наконец, вдоль медиальной границы, ближайшей к позвоночнику, чтобы собрать контралатеральную мышцу.

Следуйте той же процедуре. Сначала удаляется дорсальная жировая ткань, затем вентральная жировая ткань и, наконец, вышележащая фасция при разрезании. Возможно, вам будет проще переключить инструменты на менее доминирующую руку.

Иссеченная ткань может быть зафиксирована и промыта в соответствии с процедурой, описанной здесь, после того, как животное было усыплено. Согласно усовершенствованному протоколу A CUC. Подробную информацию об альтернативной процедуре перфузионной фиксации см. в сопроводительной литературе.

Здесь мы показываем размеченную диаграмму отраженной трапециевидной мышцы позвоночника. После обнажения питательной артерии буквами обозначаются области, как и раньше. Имейте в виду, что каждое животное имеет уникальную анатомию.

Именно эта мышь считается довольно сложной для данной процедуры из-за близости двух других сосудов. Здесь показано более типичное животное. Обратите внимание на относительно большое отделение указанной артерии от паравены чуть выше нее и отсутствие третьего сосуда.

Здесь мы видим монтаж с помощью конфокального микроскопа перевязанной правосторонней трапециевидной мышцы позвоночника, которая была окрашена на альфа-актин гладкой мускулатуры. В условиях ишемии в указанной области происходит ремоделирование ниже по течению от места лигирования. Эти изменения могут быть количественно измерены с помощью программного обеспечения для анализа изображений, которое мы используем здесь для измерения извитости как отношения длины артериального пути к расстоянию между ядрами.

Некоторые приведенные здесь данные образцов указывают на статистически значимый результат увеличения извитости сосудов по сравнению с контралатеральным контролем. Мы также демонстрируем функциональные измерения реактивности сосудов с помощью медицинского программного обеспечения MicroVision a VA на автономном микроскопе темного поля. Диаметры видеососудов измеряются до и после стимуляции, а затем сравниваются друг с другом в процентном соотношении.

Приведенные здесь данные образцов указывают на статистически значимый результат увеличения диаметра сосудов терминальных артерий после стимуляции. Привет, меня зовут Александр Элл, и я студент старших курсов в лаборатории Пирса Шолера, который монтировал это видео. Вместе мы только что показали вам, как создать модель ишемии скелетных мышц в зеркальной спиновой трапециевидной мышце.

Затем мы продемонстрировали функциональную процедуру вазодилатации, подходящую для измерения сосудистой реактивности и контроля кровотока. В прошлом мы показали, как иссекать мышцу для подготовки к фиксации, подходящей для иммунохимического окрашивания и визуализации. От имени моих коллег в Сан-Луис-Обиспо и здесь, в Шарлоттсвилле, я хотел бы поблагодарить вас за наблюдение и пожелать вам прощания и удачи в ваших исследовательских начинаниях.