Введение в работу с микропланшетным ридером

Считыватель микропланшетов — это широко используемый прибор, который позволяет одновременно измерять множество образцов, как если бы одновременно проводилось множество миниатюрных экспериментов.

Данный аппарат используется совместно с многолуночными планшетами, например, с 96-луночным планшетом.

Независимо от типа эксперимента, проводимого с помощью считывателя микропланшетов, для определения значений экспериментальных образцов, а также положительного и отрицательного контроля часто используются стандартные кривые.

Микропланшетные ридеры различаются по форме, размеру и конфигурации. Многие из них обладают мультимодальными возможностями, что позволяет проводить множество различных видов анализа. Эти модальности включают возможность выполнения различных типов измерений, таких как абсорбционные, флуоресцентные и люминесцентные измерения.

Многолуночные планшеты являются неотъемлемыми компонентами микропланшетного ридера и используются для размещения образцов, измеряемых прибором. Такие планшеты могут иметь разные размеры, различные типы дна лунок и разное количество лунок. Выбор типа планшета зависит от конкретного анализа.

Загрузочный лоток используется для подачи 96-луночного планшета в прибор.

Для управления ридером и настройки его параметров, таких как длина волны и режим работы, обычно используется компьютерный интерфейс. Программное обеспечение ридера имеет графический интерфейс планшета, который позволяет выбрать лунки, в которые помещены образцы.

Для заполнения многолуночных планшетов часто используются многоканальные дозаторы. Резервуары служат для удержания растворов, используемых с многоканальным дозатором.

Иногда лунки можно заполнять с помощью стандартного одноканального дозатора.

Образцы и стандарты вносят в двух или трех повторностях, чтобы учесть возможные ошибки пипетирования. Здесь представлен планшет, заполненный в трех повторностях.

Для построения калибровочной кривой используются образцы с известными концентрациями, которые дают различные значения оптической плотности. Эти данные затем используются для построения графика, на котором проводится линия наилучшего соответствия.

Холостой опыт (бланк) используется для определения той части измерения, которая не имеет экспериментального значения и обусловлена буферами, в которых разведен образец, или реагентами, с которыми он взаимодействует. Значения, полученные в результате таких измерений, называют «фоном». Холостой опыт не содержит образца.

Положительный контроль показывает, правильно ли сработал анализ; он должен дать положительный результат. Отрицательный контроль представляет собой контрольную переменную, при которой не ожидается обнаружения какого-либо сигнала или эффекта; он не должен давать результата.

После подготовки планшета можно приступать к внесению образцов. Чтобы избежать измерения не тех образцов или неправильной загрузки планшета, крайне важно правильно ориентировать его в загрузочном лотке. Помните о необходимости соблюдать осторожность при установке лотка, чтобы не заталкивать его в прибор силой и не зажать пальцы внутри прибора.

После загрузки лотка в программном обеспечении перед считыванием планшета устанавливаются такие параметры, как режим, длина волны и порядок считывания лунок.

После установки параметров производится считывание планшета, и ридер генерирует вывод значений в программном обеспечении.

После считывания планшета используйте среднее значение холостых проб, чтобы вычесть фон из всех образцов, включая стандарты калибровочной кривой.

После считывания известные значения концентраций стандартов откладываются относительно соответствующих измеренных значений, в данном случае — оптической плотности.

Когда значения нанесены на график, линию наилучшего соответствия можно рассчитать с помощью линейной регрессии. Это легко сделать в программе для работы с электронными таблицами.

Коэффициент детерминации, статистический показатель того, насколько точно линия предсказывает фактические точки данных, должен находиться в диапазоне 0,90–0,99, при этом значение 0,99 считается наилучшим и означает, что линия идеально соответствует данным.

Используя линию наилучшего соответствия, мы можем рассчитать значения концентрации экспериментальных образцов или контролей в каждой лунке, подставив значение оптической плотности вместо Y и затем решив уравнение относительно X. Значения концентрации также можно оценить, проведя линию от значения оптической плотности на оси Y до линии наилучшего соответствия, а затем вниз к оси X.

Многие типы микропланшетных ридеров измеряют абсорбцию, которая определяется как логарифмическое отношение интенсивности падающего на объект света к интенсивности света, прошедшего через этот объект.

Метод Брэдфорд является примером анализа с использованием микропланшетного ридера на основе измерения абсорбции, при котором образцы белков добавляют в планшет с реагентом Брэдфорда. Это соединение связывается с белками в образце, что вызывает сдвиг его абсорбции.

В анализах на основе флуоресценции флуорохром активируется светом определенной длины волны, что приводит к возбуждению флуорохрома, который излучает свет на другой длине волны.

При работе со светочувствительными реагентами обязательно держите их закрытыми, чтобы предотвратить фотообесцвечивание и порчу эксперимента.

Люминесцентные анализы основаны на излучении света в результате химической реакции и часто используют люциферазу. Люцифераза получается из различных источников, например, из светлячков. В реакции люциферазы свет излучается при взаимодействии люциферазы с кислородом, ATP и магнием в ходе серии реакций.

Люминесцентные анализы имеют множество различных применений. Примером такого применения является измерение продукции и обнаружение активных форм кислорода при раке.

Другие области применения микропланшетных ридеров включают высокопроизводительный скрининг с использованием планшетов на 384 и 1536 лунок. В таких анализах планшеты загружаются роботом. Нет, не тем роботом, о котором вы подумали, а программируемым роботом, который автоматизирует чрезвычайно точную работу с образцами.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по работе с микропланшетным ридером. В этом видео мы рассказали, что представляет собой микропланшетный ридер(A), как он используется(B), как управлять этим прибором(C), как интерпретировать данные микропланшетного ридера, а также привели примеры применения микропланшетного ридера(D). Спасибо за просмотр.