Введение в считыватель микропланшетов
Считыватель микропланшетов — это широко используемый инструмент, который позволяет одновременно измерять множество образцов, как если бы одновременно проводилось множество крошечных экспериментов.
Этот аппарат используется в сочетании с многолуночными планшетами, такими как 96-луночный планшет.
Независимо от типа эксперимента, проводимого с помощью считывателя микропланшетов, для определения ценности экспериментальных образцов, а также положительного и отрицательного контроля часто используются стандартные кривые.
Считыватели микропланшетов бывают разных форм, размеров и конфигураций. Многие считыватели микропланшетов имеют мультимодальные возможности, позволяющие выполнять множество различных анализов. Эти методы включают в себя возможность выполнения различных типов измерений, таких как абсорбционные, флуоресцентные и люминесцентные измерения.
Планшеты Multiwell являются неотъемлемыми компонентами считывателя микропланшетов и используются для хранения образцов, измеряемых машиной. Эти плиты могут быть разных размеров, иметь разные типы забоев скважин и разное количество скважин. Тип используемой пластины зависит от анализа.
Загрузочный лоток используется для подачи 96-луночного планшета в машину.
Компьютерный интерфейс обычно используется для работы со считывателем пластин и управления его настройками и параметрами, такими как длина волны и мода. Программное обеспечение для чтения пластин имеет графический пользовательский интерфейс пластины, который позволяет выбирать, какие скважины будут загружены образцами.
Многоканальные пипетки часто используются для загрузки многолуночных планшетов. В резервуарах хранятся растворы для многоканальной пипетки.
Иногда лунки можно загружать с помощью стандартной одноканальной пипетки.
Образцы и стандарты загружаются в двух или трех экземплярах с учетом любых ошибок при пипетировании. Здесь вы видите тарелку, загруженную в трех экземплярах.
В стандартной кривой используются образцы с известными концентрациями, которые дают различные значения поглощения. Затем эти данные используются для создания графика, на котором генерируется линия наилучшего соответствия.
Бланк используется для определения объема измерения, который не является экспериментально релевантным и обусловлен буферами, в которых разведен образец, или реагентами, воздействию которых подвергается образец. Значения, полученные в результате этих измерений, называются «фоном». Бланк не содержит образца.
Положительный контроль указывает на то, правильно ли сработал анализ. Это дает хороший результат. Отрицательный контроль – это контрольная переменная, при которой не ожидается никаких измерений/эффектов. Это не должно дать никакого результата.
После того, как пластина настроена, пришло время загрузить образцы. Чтобы предотвратить измерение неправильных образцов или неправильную загрузку пластины, крайне важно правильно ориентировать пластину в загрузочном лотке. Не забывайте проявлять осторожность при загрузке образцов в лоток, чтобы не вдавить лоток внутрь инструмента или не зацепить конечности внутри инструмента.
После загрузки лотка такие параметры, как режим, длина волны и порядок загрузки скважины, устанавливаются в программном обеспечении до того, как пластина будет считана.
После установки параметров табличка считывается, и считыватель генерирует считывание значений в программном обеспечении.
После считывания пластины используйте среднее значение пустых образцов, чтобы вычесть фон из всех образцов, включая стандартную кривую.
После считывания известные значения концентрации для стандартов сопоставляются с соответствующими измеренными значениями, в данном случае с абсорбцией.
После того, как значения построены на графике, линия наилучшего вписывания может быть рассчитана с помощью линейной регрессии. Это можно легко сделать с помощью программы для работы с электронными таблицами.
Коэффициент детерминации, представляющий собой статистическую меру того, насколько хорошо линия предсказывает фактические точки данных, должен находиться в диапазоне 0,90-0,99, при этом 0,99 считается лучшим значением и означает, что линия идеально соответствует данным.
Используя линию наилучшего соответствия, мы можем рассчитать значения концентрации экспериментальных образцов или контрольных образцов в каждой скважине, подключив значение поглощения для Y, а затем решив уравнение для X. Значения концентрации также можно оценить, проведя линию от значения поглощения по оси Y к линии наилучшего соответствия, а затем вниз к оси X.
Многие типы считывателей микропланшетов измеряют поглощение, которое определяется как логарифмическое отношение света, падающего на объект, к свету, проходящему через объект.
Анализ Брэдфорда является примером анализа на основе абсорбции с помощью считывателя микропланшетов, в котором образцы белка добавляются на планшет с реагентом «Брэдфорд». Это соединение связывается с белками в образце и вызывает сдвиг в его абсорбции.
В флуоресцентных анализах флуорохром активируется определенной длиной волны света и, в свою очередь, вызывает возбуждение флуорохрома, который излучает свет на другой длине волны.
При работе со светочувствительными реактивами обязательно держите их в тени, чтобы предотвратить фотообесцвечивание и порчу эксперимента.
Люминесцентные анализы излучают свет в результате химической реакции и часто используют люциферазу. Люциферазу получают из ряда источников, таких как светлячки. В люциферазной реакции свет испускается, когда люцифераза сталкивается с кислородом, АТФ и магнием в серии реакций.
Люминесцентные анализы имеют множество различных применений. Примером такого применения является измерение производства и обнаружения активных форм кислорода в раковых опухолях.
Другие области применения, в которых используются считыватели микропланшетов, включают высокопроизводительные анализы с использованием 384- и 1536-лунок. В этих анализах планшеты загружаются роботом. Нет, не такой робот. Программируемый робот, который автоматизирует чрезвычайно точную обработку образцов.
Вы только что посмотрели введение JoVE в считыватель микропланшетов. В этом видео мы показали, что такое считыватель микропланшетов (A), как он используется (B), как работать с этим прибором (C), как интерпретировать данные считывателя микропланшетов и некоторые области применения с использованием считывателя микропланшетов (D). Спасибо за просмотр.
Считыватель микропланшетов — это мультимодальный прибор, который позволяет одновременно проводить и измерять множество экспериментов. Считыватели микр…
Считыватель микропланшетов — это широко используемый инструмент, который позволяет одновременно измерять множество образцов, как если бы одновременно проводилось множество крошечных экспериментов.
Этот аппарат используется в сочетании с многолуночными планшетами, такими как 96-луночный планшет.
Независимо от типа эксперимента, проводимого с помощью считывателя микропланшетов, для определения ценности экспериментальных образцов, а также положительного и отрицательного контроля часто используются стандартные кривые.
Считыватели микропланшетов бывают разных форм, размеров и конфигураций. Многие считыватели микропланшетов имеют мультимодальные возможности, позволяющие выполнять множество различных анализов. Эти методы включают в себя возможность выполнения различных типов измерений, таких как абсорбционные, флуоресцентные и люминесцентные измерения.
Планшеты Multiwell являются неотъемлемыми компонентами считывателя микропланшетов и используются для хранения образцов, измеряемых машиной. Эти плиты могут быть разных размеров, иметь разные типы забоев скважин и разное количество скважин. Тип используемой пластины зависит от анализа.
Загрузочный лоток используется для подачи 96-луночного планшета в машину.
Компьютерный интерфейс обычно используется для работы со считывателем пластин и управления его настройками и параметрами, такими как длина волны и мода. Программное обеспечение для чтения пластин имеет графический пользовательский интерфейс пластины, который позволяет выбирать, какие скважины будут загружены образцами.
Многоканальные пипетки часто используются для загрузки многолуночных планшетов. В резервуарах хранятся растворы для многоканальной пипетки.
Иногда лунки можно загружать с помощью стандартной одноканальной пипетки.
Образцы и стандарты загружаются в двух или трех экземплярах с учетом любых ошибок при пипетировании. Здесь вы видите тарелку, загруженную в трех экземплярах.
В стандартной кривой используются образцы с известными концентрациями, которые дают различные значения поглощения. Затем эти данные используются для создания графика, на котором генерируется линия наилучшего соответствия.
Бланк используется для определения объема измерения, который не является экспериментально релевантным и обусловлен буферами, в которых разведен образец, или реагентами, воздействию которых подвергается образец. Значения, полученные в результате этих измерений, называются «фоном». Бланк не содержит образца.
Положительный контроль указывает на то, правильно ли сработал анализ. Это дает хороший результат. Отрицательный контроль – это контрольная переменная, при которой не ожидается никаких измерений/эффектов. Это не должно дать никакого результата.
После того, как пластина настроена, пришло время загрузить образцы. Чтобы предотвратить измерение неправильных образцов или неправильную загрузку пластины, крайне важно правильно ориентировать пластину в загрузочном лотке. Не забывайте проявлять осторожность при загрузке образцов в лоток, чтобы не вдавить лоток внутрь инструмента или не зацепить конечности внутри инструмента.
После загрузки лотка такие параметры, как режим, длина волны и порядок загрузки скважины, устанавливаются в программном обеспечении до того, как пластина будет считана.
После установки параметров табличка считывается, и считыватель генерирует считывание значений в программном обеспечении.
После считывания пластины используйте среднее значение пустых образцов, чтобы вычесть фон из всех образцов, включая стандартную кривую.
После считывания известные значения концентрации для стандартов сопоставляются с соответствующими измеренными значениями, в данном случае с абсорбцией.
После того, как значения построены на графике, линия наилучшего вписывания может быть рассчитана с помощью линейной регрессии. Это можно легко сделать с помощью программы для работы с электронными таблицами.
Коэффициент детерминации, представляющий собой статистическую меру того, насколько хорошо линия предсказывает фактические точки данных, должен находиться в диапазоне 0,90-0,99, при этом 0,99 считается лучшим значением и означает, что линия идеально соответствует данным.
Используя линию наилучшего соответствия, мы можем рассчитать значения концентрации экспериментальных образцов или контрольных образцов в каждой скважине, подключив значение поглощения для Y, а затем решив уравнение для X. Значения концентрации также можно оценить, проведя линию от значения поглощения по оси Y к линии наилучшего соответствия, а затем вниз к оси X.
Многие типы считывателей микропланшетов измеряют поглощение, которое определяется как логарифмическое отношение света, падающего на объект, к свету, проходящему через объект.
Анализ Брэдфорда является примером анализа на основе абсорбции с помощью считывателя микропланшетов, в котором образцы белка добавляются на планшет с реагентом «Брэдфорд». Это соединение связывается с белками в образце и вызывает сдвиг в его абсорбции.
В флуоресцентных анализах флуорохром активируется определенной длиной волны света и, в свою очередь, вызывает возбуждение флуорохрома, который излучает свет на другой длине волны.
При работе со светочувствительными реактивами обязательно держите их в тени, чтобы предотвратить фотообесцвечивание и порчу эксперимента.
Люминесцентные анализы излучают свет в результате химической реакции и часто используют люциферазу. Люциферазу получают из ряда источников, таких как светлячки. В люциферазной реакции свет испускается, когда люцифераза сталкивается с кислородом, АТФ и магнием в серии реакций.
Люминесцентные анализы имеют множество различных применений. Примером такого применения является измерение производства и обнаружения активных форм кислорода в раковых опухолях.
Другие области применения, в которых используются считыватели микропланшетов, включают высокопроизводительные анализы с использованием 384- и 1536-лунок. В этих анализах планшеты загружаются роботом. Нет, не такой робот. Программируемый робот, который автоматизирует чрезвычайно точную обработку образцов.
Вы только что посмотрели введение JoVE в считыватель микропланшетов. В этом видео мы показали, что такое считыватель микропланшетов (A), как он используется (B), как работать с этим прибором (C), как интерпретировать данные считывателя микропланшетов и некоторые области применения с использованием считывателя микропланшетов (D). Спасибо за просмотр.
Считыватель микропланшетов — это широко используемый инструмент, который позволяет одновременно измерять множество образцов, как если бы одновременно проводилось множество крошечных экспериментов.
Этот аппарат используется в сочетании с многолуночными планшетами, такими как 96-луночный планшет.
Независимо от типа эксперимента, проводимого с помощью считывателя микропланшетов, для определения ценности экспериментальных образцов, а также положительного и отрицательного контроля часто используются стандартные кривые.
Считыватели микропланшетов бывают разных форм, размеров и конфигураций. Многие считыватели микропланшетов имеют мультимодальные возможности, позволяющие выполнять множество различных анализов. Эти методы включают в себя возможность выполнения различных типов измерений, таких как абсорбционные, флуоресцентные и люминесцентные измерения.
Планшеты Multiwell являются неотъемлемыми компонентами считывателя микропланшетов и используются для хранения образцов, измеряемых машиной. Эти плиты могут быть разных размеров, иметь разные типы забоев скважин и разное количество скважин. Тип используемой пластины зависит от анализа.
Загрузочный лоток используется для подачи 96-луночного планшета в машину.
Компьютерный интерфейс обычно используется для работы со считывателем пластин и управления его настройками и параметрами, такими как длина волны и мода. Программное обеспечение для чтения пластин имеет графический пользовательский интерфейс пластины, который позволяет выбирать, какие скважины будут загружены образцами.
Многоканальные пипетки часто используются для загрузки многолуночных планшетов. В резервуарах хранятся растворы для многоканальной пипетки.
Иногда лунки можно загружать с помощью стандартной одноканальной пипетки.
Образцы и стандарты загружаются в двух или трех экземплярах с учетом любых ошибок при пипетировании. Здесь вы видите тарелку, загруженную в трех экземплярах.
В стандартной кривой используются образцы с известными концентрациями, которые дают различные значения поглощения. Затем эти данные используются для создания графика, на котором генерируется линия наилучшего соответствия.
Бланк используется для определения объема измерения, который не является экспериментально релевантным и обусловлен буферами, в которых разведен образец, или реагентами, воздействию которых подвергается образец. Значения, полученные в результате этих измерений, называются «фоном». Бланк не содержит образца.
Положительный контроль указывает на то, правильно ли сработал анализ. Это дает хороший результат. Отрицательный контроль – это контрольная переменная, при которой не ожидается никаких измерений/эффектов. Это не должно дать никакого результата.
После того, как пластина настроена, пришло время загрузить образцы. Чтобы предотвратить измерение неправильных образцов или неправильную загрузку пластины, крайне важно правильно ориентировать пластину в загрузочном лотке. Не забывайте проявлять осторожность при загрузке образцов в лоток, чтобы не вдавить лоток внутрь инструмента или не зацепить конечности внутри инструмента.
После загрузки лотка такие параметры, как режим, длина волны и порядок загрузки скважины, устанавливаются в программном обеспечении до того, как пластина будет считана.
После установки параметров табличка считывается, и считыватель генерирует считывание значений в программном обеспечении.
После считывания пластины используйте среднее значение пустых образцов, чтобы вычесть фон из всех образцов, включая стандартную кривую.
После считывания известные значения концентрации для стандартов сопоставляются с соответствующими измеренными значениями, в данном случае с абсорбцией.
После того, как значения построены на графике, линия наилучшего вписывания может быть рассчитана с помощью линейной регрессии. Это можно легко сделать с помощью программы для работы с электронными таблицами.
Коэффициент детерминации, представляющий собой статистическую меру того, насколько хорошо линия предсказывает фактические точки данных, должен находиться в диапазоне 0,90-0,99, при этом 0,99 считается лучшим значением и означает, что линия идеально соответствует данным.
Используя линию наилучшего соответствия, мы можем рассчитать значения концентрации экспериментальных образцов или контрольных образцов в каждой скважине, подключив значение поглощения для Y, а затем решив уравнение для X. Значения концентрации также можно оценить, проведя линию от значения поглощения по оси Y к линии наилучшего соответствия, а затем вниз к оси X.
Многие типы считывателей микропланшетов измеряют поглощение, которое определяется как логарифмическое отношение света, падающего на объект, к свету, проходящему через объект.
Анализ Брэдфорда является примером анализа на основе абсорбции с помощью считывателя микропланшетов, в котором образцы белка добавляются на планшет с реагентом «Брэдфорд». Это соединение связывается с белками в образце и вызывает сдвиг в его абсорбции.
В флуоресцентных анализах флуорохром активируется определенной длиной волны света и, в свою очередь, вызывает возбуждение флуорохрома, который излучает свет на другой длине волны.
При работе со светочувствительными реактивами обязательно держите их в тени, чтобы предотвратить фотообесцвечивание и порчу эксперимента.
Люминесцентные анализы излучают свет в результате химической реакции и часто используют люциферазу. Люциферазу получают из ряда источников, таких как светлячки. В люциферазной реакции свет испускается, когда люцифераза сталкивается с кислородом, АТФ и магнием в серии реакций.
Люминесцентные анализы имеют множество различных применений. Примером такого применения является измерение производства и обнаружения активных форм кислорода в раковых опухолях.
Другие области применения, в которых используются считыватели микропланшетов, включают высокопроизводительные анализы с использованием 384- и 1536-лунок. В этих анализах планшеты загружаются роботом. Нет, не такой робот. Программируемый робот, который автоматизирует чрезвычайно точную обработку образцов.
Вы только что посмотрели введение JoVE в считыватель микропланшетов. В этом видео мы показали, что такое считыватель микропланшетов (A), как он используется (B), как работать с этим прибором (C), как интерпретировать данные считывателя микропланшетов и некоторые области применения с использованием считывателя микропланшетов (D). Спасибо за просмотр.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a microplate reader and how does it work?
A microplate reader is an instrument that simultaneously measures many samples using multiwell plates, such as 96-well plates. It performs multiple miniature experiments at once by detecting different types of measurements including absorbance, fluorescence, and luminescence. The computer interface controls settings like wavelength and mode to automate sample analysis across all wells.
Q2: Why are standard curves used in microplate reader assays?
Standard curves determine experimental sample values by using samples with known concentrations that yield different absorbance values. A line of best fit is generated from this data, allowing unknown sample concentrations to be calculated or estimated. The coefficient of determination should be between 0.90-0.99 to ensure the line accurately predicts actual data points.
Q3: What role do controls play in microplate reader experiments?
Blanks determine background measurement not related to the experiment, using buffers or reagents without samples. Positive controls confirm the assay worked properly by yielding expected results. Negative controls show no measurement or effect should occur. Together, these controls validate assay accuracy and identify any experimental errors or contamination.
Q4: How should samples be loaded into a microplate for accurate results?
Samples and standards are loaded in duplicate or triplicate to account for pipetting errors. Multichannel pipettes are often used for efficient loading, though single-channel pipettes work for individual wells. Proper plate orientation in the loading tray is critical to prevent measuring wrong samples. Exercise caution when loading to avoid forcing the tray or catching extremities in the instrument.
Q5: What are the different measurement types available on multimodal microplate readers?
Multimodal microplate readers can perform absorbance measurements, which detect light transmitted through samples; fluorescence measurements, where a fluorochrome is excited by light and emits at a different wavelength; and luminescence measurements, which detect light from chemical reactions like luciferase. Light-sensitive reagents must be kept covered to prevent photobleaching and preserve experiment integrity.
Q6: How is background subtraction performed after reading a microplate?
After the plate is read, the average value of blank samples is calculated and subtracted from all sample measurements, including the standard curve. This removes background noise caused by buffers or reagents not related to the experiment. Background subtraction ensures that measured values reflect only the experimental signal of interest.
Q7: What are common applications of microplate readers in research?
Microplate readers quantify protein levels, measure gene expression, and detect metabolic processes such as reactive oxygen species production in cancer research and calcium flux. High-throughput assays using 384- and 1536-well plates employ programmable robots for automated, precise sample handling. These applications enable rapid analysis of thousands of samples simultaneously.
Главы в этом видео
0:00
Overview
0:42
Components of a Microplate Reader
1:53
Using a Microplate Reader with a 96-well Plate
5:30
Applications
7:24
Summary