Сотовые Co-культуре Создание массивов с использованием водных двухфазных системах

Общая цель этой процедуры заключается в непосредственном моделировании клеток в полностью водных средах. Это достигается путем предварительного растворения длинноцепочечных полимеров, таких как полиэтиленгликоль и декстрин, в отдельных пробирках, содержащих среду для культивирования клеток. Второй шаг – трипс аниса, сбор гранул и ресуспендирование клеток при нужной плотности посева в одном или обоих полимерных растворах.

Затем полимерные растворы дозируют на чашке для клеточных культур. Несовместимость двух полимеров позволяет создавать пространственные структуры двух полностью водных жидкостей. Ячейки могут быть включены либо в полимерный раствор, либо в оба полимерных раствора для получения различных узоров.

Заключительным этапом является удаление полимерных растворов после того, как клетки прилипнут в течение четырех часов или дольше, и замена их питательной средой. В конечном счете, для подтверждения структуры клеток можно использовать светлопольную или флуоресцентную микроскопию. Основное преимущество этой техники перед существующими методами, такими как микроконтактная печать, заключается в том, что клетки моделируются в полностью водной среде с помощью простых инструментов, таких как микротрубки.

Этот метод может быть использован для тканевой инженерии для оценки миграции клеток и исследования перикринной и аутокринной передачи сигналов от клетки к клетке, демонстрируя эти процедуры, Абрахам, студент бакалавриата, и Джошуа Уайт, аспирант из лаборатории Такаяма. Начните с растворения двух разных полимеров в конкретной среде, которая будет использоваться в ваших экспериментах. В этом примере полиэтиленгликоль, также известный как ПЭГ, и Декстрин, также известный как Декс, имеют молекулярные массы 35 килодальтон и 500 килодальтон соответственно.

Подготовьте 16 образцов по два миллилитра в конических пробирках объемом 15 миллилитров, каждая из которых содержит разные концентрации ПЭГ и декса, как показано на приведенной здесь таблице. Для этого взвесьте соответствующие количества PEG и dex в соответствии с таблицей и смешайте их в среде, осторожно покачивая до полного растворения обоих полимеров. Это может занять несколько часов после полного растворения полимеров.

Раствор должен быть мутным. Подтвердите разделение фаз путем центрифугирования образцов при давлении 1000 G в течение пяти минут. Более плотная нижняя фаза будет богата dex.

Верхняя фаза будет богата колышками. Далее медленно добавьте в пробирки 0,1 миллилитра дополнительной среды и перебейте образцы в течение 20 секунд. Затем снова центрифугируйте образцы, чтобы проверить разделение фаз.

Раствор становится прозрачным после добавления дополнительных объемов среды, повторите этот шаг, добавив еще 0,1 миллилитра среды, перемешайте и центрифугируйте образцы до тех пор, пока раствор не станет прозрачным и больше не будет разделяться по фазам. Это указывает на то, что пороговое значение критической точки было достигнуто для данной конкретной смеси. Запишите окончательный вес каждой пробирки на этом этапе.

Наконец, определите процентное соотношение веса к весу двух полимеров в точке разделения торца. Постройте узловую кривую бункера, поместив процент веса на грузовой штифт по оси y и процент веса на грузовые деки по оси X. Эта кривая представляет собой пороговые концентрации для разделения граней ПЭГ и ДЕКС в этой среде.

Чтобы начать выделение паттернов ячеек, готовят отдельные растворы ПЭГ и декса при значениях, удвоенных их критических точках, определяемых порогом узла бинов. Для этих экспериментов 5% веса на вес ПЭГ и 12,8% веса на вес колоды добавляют в DMEM с 10% FBS и 1% антибиотиков. Трубки помещаются на коромысло, чтобы они полностью растворились.

Затем соберите клетки, которые будут использоваться для моделирования исключения для этого эксперимента, клетки hela при 80% слиянии инцируются с использованием 0,5% трипсина в течение трех минут. После сбора урожая подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра, затем гранулируйте и ресуспендируйте клетки в концентрации 375 000 клеток на миллилитр в среде с добавлением 5% ПЭГ. При такой концентрации образуются образцы, которые после культивирования станут сливающимися на следующий день.

Затем с помощью микродозатора диспонируйте 0,5 микролитра 12,8%-ного раствора на сухую 96-луночную пластину для выделения узора. Каплям Dex можно дать высохнуть в стерильных условиях для последующего использования. Затем медленно влейте в лунку 200 микролитров суспензии гела-клеток PEG.

Чтобы покрыть капли D, важно сначала накрыть каплю D раствором PEG, прежде чем заполнять окружающие участки, так как это предотвращает разрушение капли при ее распространении по скважине. После того, как все лунки будут сформированы и тщательно засеяны, поместите планшет для клеточной культуры во увлажненный инкубатор. Убедитесь, что чашка не наклоняется во время работы и что она размещена на ровной полке инкубатора, чтобы не нарушить шаблоны после того, как ячейки прилипнут в течение 12 часов.

Удалите раствор ПЭГ и трижды промойте 200 микролитрами питательной среды, чтобы удалить остатки полимеров. Затем добавьте 200 микролитров свежей питательной среды и верните тарелку в инкубатор. Периодически контролируйте культуры, чтобы наблюдать за пролиферацией и миграцией клеток в зоны отчуждения.

Приготовьте растворы из 5% массы на вес ПЭГ и 12,8% массы на весовые колоды в среде для клеточных культур. Также соберите клетки хела, которые будут использоваться для формирования островков, и снова определите общее количество доступных клеток с помощью гемоцитометра. Далее пеллеты и ресус.

Вращайте клетки со скоростью 5 миллионов клеток на миллилитр в среде. Продолжая 12,8% dex, может потребоваться более высокая концентрация клеток для достижения слияния в течение 24 часов, если клетки не прилипают так же хорошо, как клетки пятки. Далее пипеткой внесите по 200 микролитров раствора ПЭГ в каждую лунку 96-луночного планшета.

Затем медленно добавьте 0,5 микролитра суспензии палубных клеток в каждую лунку, содержащую раствор ПЭГ. Капли опустятся на дно и соприкоснутся с поверхностью культуры. Затем осторожно перенесите тарелку в инкубатор, стараясь ни в коем случае не наклонить блюдо, что может нарушить узоры через 12 часов.

Удалите раствор ПЭГ и трижды промойте 200 микролитрами питательной среды. Затем добавьте 200 микролитров свежей питательной среды и верните тарелку в инкубатор. Периодически контролируйте культуры, чтобы наблюдать за пролиферацией клеток и миграцией за пределы островов.

Начните совместное моделирование с приготовления растворов 5% веса на вес ПЭГ и 12,8% веса на вес колод в DMEM с 10% FPS и 1% антибиотиков. В то же время здесь мы будем использовать Hep G, два C3 a гепатоцитарные островки с окружающими их фибробластами NIH three T. Затем соберите два типа клеток и подсчитайте их отдельно с помощью гемоцитометра.

Эти два типа клеток можно легко различить с помощью гранул светлопольной микроскопии, Hep G двух C3 A гепатоцитов для островного структурирования и ресс расходуются в 12,8% дек. Затем гранулируют фибробласты для исключения, структурирования и ресуспензии в 5%-ном ПЭГ. Затем нанесите 0,5 микролитра суспензии D-клеток на сухую 96-луночную пластину и аккуратно покройте капли dex 200 микролитрами суспензии PEG-клеток.

Затем перенесите тарелку в инкубатор через 12 часов. Удалите среду и трижды промойте 200 микролитрами питательной среды. Затем добавьте 200 микролитров свежей питательной среды и верните тарелку в инкубатор.

Наконец, мониторинг интенсивности окрашивания ко-культур альбумином может быть использован для оценки благотворного влияния ко-культуры фибробластов. Концентрации полимеров, необходимые для образования различных водных двухфазных систем, описываются здесь бин-узловыми кривыми при концентрациях выше бин-узловой кривой. Система образует две фазы ниже узловой кривой бункера.

Решение представляет собой прозрачные однофазные двухфазные системы не менее чем в два раза. Концентрации тех, которые находятся на бинальной кривой, достаточны для использования в водных двухфазных системах, описанных в этом видео. Первым примером их использования является шаблон исключения, при котором небольшие участки могут быть оставлены свободными от клеток.

Островное структурирование создает полную противоположность исключению, когда небольшие области могут быть размещены с ячейками. Комбинация этих двух процедур может быть использована для формирования уникальной кокультуры, в которой островок клеток может быть окружен другим типом клеток, как показано здесь. Клетки Hela, покрытые с использованием исключающего паттерна, будут размножаться и мигрировать, чтобы заполнить пустоту.

Со временем. Размер пустоты можно контролировать, чтобы получить ценную информацию о миграции и росте клеток в различных условиях. С другой стороны, для измерения роста клеток можно использовать с помощью островкового узора.

Сочетание островной структуры и модели исключения создает четко определенные регионы сокультуры. Здесь показаны островки гепатоцитов, окруженные клетками фибробластов. Было обнаружено, что эти колонии сохраняли свою организацию в культуре по крайней мере в течение четырех дней.

Используя эту систему, на одной тарелке можно выращивать несколько островков клеток. При выращивании в виде островов гепатоциты производили немного меньше альбумина, чем при выращивании в культуре с фибробластами. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о необходимости использования концентраций полимеров в два раза выше критической концентрации для получения двухфазных растворов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как сформулировать водную двухфазную систему и использовать ее для моделирования ячеек и определения геометрии.