Подготовка гистологического материала для световой микроскопии

Гистология – это термин, который относится к изучению микроскопической анатомии тканей и клеток. Правильная подготовка гистологического образца для световой микроскопии имеет важное значение для получения качественных результатов из образцов тканей.

Существует 3 основных этапа, общих для почти всех гистологических процедур. Сначала образец фиксируется, чтобы сохранить ткань и замедлить ее деградацию. Затем образец погружают в материал, или закладную среду, который имеет схожие с ним механические свойства. После встраивания образец разрезается на тонкие ломтики с помощью точного режущего инструмента, известного как микротом. В этом видео описываются эти общие шаги и некоторые понятия, которые к ним относятся.

Фиксация тканей является критически важным этапом, который сохраняет клетки и компоненты тканей и поддерживает их структуру. После смерти клетки природные ферменты высвобождаются из клеточных органелл и начинают разрушать белки по всей клетке и внеклеточному матриксу, тем самым разрушая структуру клетки. Фиксация предотвращает такую деградацию, напрямую подавляя способность этих ферментов переваривать белок и делая участки расщепления фермента неузнаваемыми.

Двумя основными механизмами фиксации являются поперечное сшивание и коагуляция. Кросс-линкинг включает в себя образование ковалентных связей как внутри белков, так и между ними, что заставляет ткани становиться жестче и, следовательно, сопротивляться деградации. Коагуляция вызвана обезвоживанием белков с помощью спиртов или ацетона, которые деформируют третичную структуру белка, так что гидрофобные или боящиеся воды области перемещают поверхность белка. Коагуляционная фиксация может помочь встраиваемым средам, таким как парафин, проникать в ткани.

Одним из наиболее часто используемых фиксаторов является формалин, который представляет собой формальдегид, растворенный в воде. Во время фиксации формальдегид прикрепляется к первичным аминам, таким как те, которые находятся на боковых цепях аминокислот лизина и глутамина, образуя стабильную поперечную связь, называемую металеновым мостом. Этот процесс по своей сути медленный и может занять до 1-2 дней.

Перед фиксацией следует учесть несколько моментов. Во-первых, учитывайте диффузию образца. Фиксаторы будут диффундировать на расстояние через ткани со скоростью, равной коэффициенту диффузии фиксатора, умноженному на квадратный корень из времени. Фиксатору, которому требуется 1 час, чтобы проникнуть в образец на 1 мм, потребуется 25 часов, чтобы проникнуть на 5 мм. Как только формалин достигнет центра ткани, должна произойти реакция сшивания. Таким образом, размер образца должен быть ограничен 4 мм в толщину для тщательной фиксации за разумное время.

Во-вторых, учитывайте объем и pH фиксатора. Отношение фиксатора к объему образца должно быть не менее 40:1, чтобы реагент не истощался с течением времени. В то время как некоторые фиксаторы предназначены для работы при кислом pH, формалин лучше всего работает при буферизации с фосфатом для поддержания нейтрального pH, чтобы не вырабатывался избыток кислоты, который вызывает артефакты в тканях.

Следующим этапом гистологической подготовки является встраивание, которое включает в себя поддержку образцов в среде, имеющей механическую жесткость, аналогичную механической жесткости самого образца. Выбор правильной среды для заделки имеет решающее значение, потому что если она слишком жесткая или слишком слабая, при секировании могут возникнуть дефекты. Безусловно, наиболее распространенным материалом, используемым для заделки, является парафин.

Перед заделкой парафином образцы должны быть обезвожены, заменив воду в ткани сначала этанолом, затем ксилолами, а затем нагретым парафином. После того, как воск проник в образец, его тщательно позиционируют и окружают дополнительным воском с помощью формы для формирования блока. Далее образцы прикрепляются к тканевой кассете для срезов.

Секционирование — это процесс вырезания тонких ломтиков образца из закладного блока. Срезы обычно имеют толщину порядка 4-10 мкм для использования в световой микроскопии.

Для резки секций металлический, стеклянный или алмазный диск сначала закрепляется на микротоме. Затем образец помещается в держатель для образцов. Затем образец продвигается к режущей поверхности и проводится по лезвию, чтобы создать ломтик желаемой толщины. Секции будут собираться в виде тонких лент, которые можно разместить на стеклянных предметных стеклах.

После секционирования образцы размещаются на предметных стеклах. Для образцов, залитых парафином, срезы сначала помещают на водяную баню с подогретой водой, а затем поднимают из воды на предметное стекло и дают им высохнуть.

Биологическая ткань имеет очень малый внутренний контраст, поэтому после гистологии предметные стекла обычно окрашиваются красителями или антителами, которые подчеркивают морфологию или конкретные белки. Наиболее распространенным окрашиванием является гематоксилин и эозин, или H&E. Поскольку это настолько распространено, многие автоматизированные машины были созданы для воспроизводимого окрашивания многочисленных срезов H&E. Гематоксилин окрашивает ядра клеток в синий цвет, а эозин окрашивает цитоплазму в розовый цвет, раскрывая клеточную морфологию тканей.

Одним из недостатков фиксации является то, что сшивка белков может помочь антителам мечения найти свои места связывания. Вместо фиксации для сохранения образцов можно использовать быстрое замораживание тканей или мгновенное замораживание, за которым следует техника секционирования, называемая криосекцией

Образцы тканей встраиваются и ориентируются в специальной замораживающей среде, называемой OCT, или среде с оптимальной температурой резки, а затем быстро замораживаются. Как и другие встраиваемые среды, OCT соответствует жесткости образца.

Криомикротом или криостат используется для резки замороженных срезов, и этот инструмент поддерживает внутреннюю температуру -20°C, чтобы режущее лезвие и образцы оставались холодными. В отличие от срезов, залитых парафином, замороженные срезы можно поднимать непосредственно на положительно заряженное стекло сразу после срезовки.

Еще один способ избежать фиксации – это встраивание агара, при котором образцы покрываются свежеприготовленной жидкой агарозой. Когда агароза остывает, она фиксирует ткань на месте, и излишки агарозы могут быть обрезаны.

Вибротомы, еще одна альтернатива микротому, имеют лезвие, которое вибрирует и перемещается по образцу, погруженному в агарозу. Вибротомы используются для создания толстых срезов порядка 50-1000 мкм из заложенных образцов агарозы.

Образцы обычно удаляются из агарозы перед окрашиванием, а затем помещаются на предметное стекло, окруженное веществом, таким как вакуумная смазка, которая предотвращает сдавливание образца покровным стеклом. Их лучше всего рассматривать с помощью конфокальной микроскопии, чтобы получить изображения с высоким разрешением каждого толстого среза.

Вы только что посмотрели видео JoVE о гистологической подготовке образцов для световой микроскопии.

Теперь вы должны понимать шаги, необходимые для подготовки образца, чтобы перейти от куска ткани к окрашиваемому срезу. Как всегда, спасибо за просмотр!