Пиросеквенирования для идентификации микроорганизмов и характеристика

Общей целью данного эксперимента является идентификация бактерии с помощью анализа последовательности рибосомальной ДНК 16 s с использованием методологии пиросеквенирования. Это достигается путем первичной амплификации целевой ДНК с помощью полимеразной цепной реакции с использованием биотинилированного праймера. Затем биотинилированный ампликон иммобилизуют с помощью шариков сфероса, покрытых стрептавидином, и очищают с помощью промывочных буферов.

Затем ампликон денатурируется и 16 s рибосомные праймеры секвенирования ELL приводятся к одиночным цепям ДНК. Целью этого этапа является подготовка ДНК к секвенированию. Наконец, реакция секвенирования ДНК происходит с помощью пиросеквенирования — быстрого и точного метода секвенирования нуклеиновых кислот, основанного на принципе секвенирования путем синтеза.

Биотинилированный аликон используется в качестве матрицы ДНК-полимеразой для включения DN TPS по одному основанию за раз, что приводит к образованию пирофосфата. TP Sul Urease пропорционально преобразует пирофосфат в A-T-P-A-T-P, катализирует опосредованное люциферазой превращение люцифера в люцифера, что генерирует свет, пропорциональный количеству TP. Свет записывается в виде пика на пирокопическом следе и указывает на включение нуклеотидов. Неинкорпорированные DN NTP разлагаются на apras перед добавлением следующего DNTP для продолжения синтеза.

Хемилюминесцентный сигнал, записанный на рограмме, позволяет определить последовательность ДНК. Полученные результаты представляют собой последовательности рибосомных 16 SDNA, которые используются для идентификации бактерии путем сравнения с референсной базой данных рибосомной ДНК. Пиросеквенирование — это универсальный метод, который облегчает секвенирование микробного генома и может использоваться для идентификации видов бактерий, различения бактериальных штаммов и обнаружения генетических мутаций, которые придают устойчивость к противомикробным агентам.

В этом видео будет продемонстрирована процедура генерации бактериальных ампликонов, пиросеквенирования ампликонов и анализа последовательности ДНК: чтобы начать процедуру амплификации матрицы, разморозьте все необходимые растворы и тщательно перемешайте каждый из них. Все работы можно выполнять при комнатной температуре. Настройте реакцию ПЦР в соответствии с этой таблицей.

Обратите внимание, что конечная концентрация хлорида магния в 1,5 миллимоляра обеспечит удовлетворительные результаты в большинстве случаев. Однако, если требуется более высокая концентрация магния до 3,5 микролитров 25 миллимоляров, в реакцию можно добавить хлорид магния. Один праймер должен быть биотинилирован на пяти основных концах, и рекомендуется, чтобы праймер был тщательно очищен ВЭЖХ.

Перемешайте реакционную смесь, аккуратно пипетируя вверх и вниз, а затем распределите соответствующие объемы по ПЦР-пробиркам. Далее добавьте матрицу ДНК в каждую ПЦР-пробирку. Рекомендуется использовать 10 нанограммов геномной ДНК на одну реакцию.

Поместите пробирки для ПЦР в амплификатор и запустите эту программу циклирования перед приготовлением мастер-микса. Взбейте флакон с стрептококком и покрытыми покрытием бусинами seros, чтобы обеспечить однородную суспензию. Сделайте мастер-микс в соответствии с этой технологической схемой.

Сочетание шариков, связующего буфера и воды высокой чистоты в микроцентрифужной пробирке. В зависимости от объема используемого продукта ПЦР дозируется от 60 до 75 микролитров мастер-смеси в каждую лунку ПЦР-планшета таким образом, чтобы общий объем составил 80 микролитров на лунку. Добавьте от пяти до 20 микролитров биотинилированного продукта ПЦР в каждую лунку.

Объем на одну лунку теперь должен составлять 80 микролитров. Запечатайте лунки полосковыми крышками и перемешивайте ПЦР-планшет при 1 400 об/мин в течение пяти-10 минут при комнатной температуре с помощью орбитального шейкера. Начните эту процедуру с разбавления праймеров секвенирования до 0,3 микромоляра с помощью буфера на колене и дозирования по 25 микролитров в каждую лунку реакционной пластины.

Расположите пластину на вакуумной рабочей станции. Заполните желоба рабочего места в соответствии с этой схемой. 50 миллилитров 70%-ного этанола в одном желобе, 40 миллилитров денатурационного раствора в втором желобе, 50 миллилитров промывочного буфера в третьем корыте, 50 миллилитров воды высокой чистоты в четвертом корыте и 70 миллилитров воды высокой чистоты в пятом желобе.

Включите вакуумный насос и убедитесь, что переключатель вакуумного инструмента установлен в положение «Вкл.» Промывка зондов фильтра водой высокой чистоты. В пятом желобе расположите ПЦР-планшет с бусинами на рабочей станции, убедившись, что ПЦР-планшеты и реакционные планшеты находятся в одинаковой ориентации. Опустите вакуумный инструмент в лунки ПЦР-планшета.

В течение 20 секунд или до тех пор, пока весь объем не будет отсажен, шарики будут захватываться вакуумным инструментом при включенном вакууме. Промойте инструмент 70%-ным этанолом в течение 20 секунд или пока не будет аспирирован весь объем. Затем промойте инструмент раствором денатурации в течение 20 секунд или пока весь объем не будет отсаснут.

После этого промойте инструмент с помощью промывочного буфера в течение 20 секунд или пока весь объем не будет отсажен при включенном вакууме. Поднимите вакуумный инструмент выше 90 градусов по вертикали на пять секунд, чтобы вся жидкость вытекла из вакуумного инструмента. Теперь выключите насос и совместите вакуумный инструмент с тремя реактивными пластинами.

Опустите вакуумный инструмент в лунки. Затем осторожно встряхивайте из стороны в сторону в течение примерно 10 секунд, чтобы выпустить бусины в лунки, содержащие секвенирующую грунтовку. Поместите вакуумный инструмент в водяное желоб для очистки, чтобы провести секвенирование праймера до ДНК.

Поместите реакционную пластину в держатель для предварительно разогретых пластин. Нагрейте тарелку до 80 градусов Цельсия в течение двух минут. Выньте тарелку из держателя и поставьте ее на столешницу, чтобы охладить до комнатной температуры в течение пяти минут.

Начните эту процедуру с включения прибора с помощью выключателя питания, расположенного над кабелем питания, чтобы определить необходимую громкость. Настройте файл прогона в программном обеспечении прибора и в меню «Инструменты» выберите «Информация о предварительном запуске». Заправьте картридж в соответствии с инструкциями, приведенными на информационной странице перед запуском.

Поместите наконечник пипетки в угол каждой лунки как можно глубже, следя за тем, чтобы в нем не было пузырьков воздуха. Откройте затвор картриджа и вставьте картридж этикеткой вперед. Убедитесь, что картридж вставлен правильно, и закройте затвор.

Откройте рамку для удержания пластины и поместите реактивную пластину внутрь прибора. Закройте раму для удержания пластины и крышку прибора. Вставьте USB-накопитель с файлами запуска, созданными с помощью программного обеспечения инструмента, в USB-порт на передней панели печатного станка.

Окей, чтобы увидеть меню нужных файлов запуска. С помощью стрелок прокрутки выберите нужный файл запуска и нажмите кнопку «Выбрать». Когда все заданные уровни давления и температуры будут достигнуты, прибор начнет дозирование реагентов во время прогона.

На экране прибора отображается пиротехника выбранной скважины в режиме реального времени. Используйте стрелки прокрутки, чтобы просмотреть поджигатели других колодцев. Когда прибор подтвердит, что прогон завершен и файл прогона сохранен на USB-накопителе, нажмите кнопку «Закрыть».

Извлеките USB-накопитель. Здесь показаны результаты типичного прогона пиросеквенирования. Прямые и обратные праймеры для ПЦР предназначены для консервативных участков матрицы ДНК, которая представляет собой 16 s рибосомальную последовательность.

В этом примере праймер для секвенирования располагают непосредственно перед хорошо охарактеризованной идентифицирующей гипервариабельной последовательностью ДНК в ампликоне, показанном синим цветом. Эта гипервариабельная последовательность позволяет проводить бактериальную идентификацию большого числа видов бактерий с использованием консервативного праймера секвенирования в качестве внутреннего контроля качества, последовательность ДНК, заключающая в скобки вариабельную область, может быть проверена, чтобы убедиться, что был проанализирован правильный участок ДНК. Программное обеспечение для пиросеквенирования позволяет сравнивать и согласовывать сгенерированную последовательность с внутренней базой данных бактериальных рибосомных последовательностей для идентификации бактерий.

Кроме того, последовательность может быть проанализирована для определения мутаций, которые придают устойчивость к антибиотикам. Например, анализ мутаций в 23 s рибосомных генах Helicobacter pylori выявляет два паттерна мутаций, GAA или GA, которые придают устойчивость к антибиотикам. Пиросеквенирование — это универсальный метод, который облегчает секвенирование микробного генома.

Преимущества пиросеквенирования в микробиологических приложениях включают быстрый и надежный высокопроизводительный скрининг и точную идентификацию микробов и мутаций микробного генома. Кроме того, методология пиросеквенирования позволяет анализировать все генетическое разнообразие устойчивости к противомикробным препаратам, включая типирование точечных мутаций SNP, вставок и делеций, а также количественную оценку множественных копий генов, которые могут встречаться в некоторых моделях устойчивости к противомикробным препаратам. Благодарим вас за просмотр этого видео и желаем удачи в ваших экспериментах по секвенированию.