1.13: Введение в световую микроскопию

Световой микроскоп – это прибор, используемый для увеличения исследовательских образцов. Световые микроскопы являются бесценным аналитическим инструментом, который может позволить научным исследователям рассматривать объекты, в 1000 раз превышающие их первоначальный размер. Как вы увидите, световой микроскоп работает по некоторым очень простым принципам, но имеет почти безграничные возможности для визуализации образцов в лаборатории.

Как следует из названия, световой микроскоп нуждается в источнике света, который производит свет, который может быть сфокусирован на образце с помощью конденсорной линзы.

Свет, который освещает образец, достигает линзы, известной как линза объектива, которая создает увеличенное изображение, перевернутое или перевернутое вверх ногами. Окуляр, или окулярная линза, еще больше увеличивает изображение, которое затем получает глаз. Дополнительные оптические элементы могут быть введены в световой путь для коррекции изображения, чтобы глаз видел его в правильной ориентации. Микроскопы, в которых используется несколько линз, как тот, который вы видите здесь, называются составными микроскопами.

В составном микроскопе общее увеличение рассчитывается путем умножения увеличения линзы объектива на увеличение линзы глаза, или окуляра. С объективом с 40-кратным увеличением и объективом с 10-кратным увеличением общее увеличение составляет 400X.

Чтобы помочь оценить размер объектов под микроскопом, можно использовать прицельную сетку окуляра — шкалу, которая проецируется на изображение. При большем увеличении деления в прицельной сетке окуляра будут представлять меньшие расстояния, чем при просмотре при меньшем увеличении.

Помимо увеличения, еще одним аспектом оптики микроскопа является разрешение. Разрешение относится к кратчайшему разрешимому расстоянию между двумя объектами в области видимости. По мере того, как головы этих персонажей становятся все более четкими, а разрешение увеличивается, кратчайшее наблюдаемое расстояние между ними уменьшается.

Основными компонентами светового микроскопа являются объективы, окуляры, предметный столик и держатель образца, источник света, диафрагма поля, конденсор и апертура, а также ручки грубой и тонкой фокусировки.

Объективы отвечают за большую часть увеличения и разрешения микроскопа. Они установлены на вращающемся револьвере таким образом, что при изменении объективов фокальная плоскость остается прежней – свойство, называемое парафокальностью. Объектив может быть обозначен по увеличению, числовой апертуре или N.A., типу требуемой иммерсионной среды, толщине покровного стекла, которую следует использовать при монтаже образцов, и рабочему расстоянию - расстоянию от кончика линзового элемента до фокальной плоскости в образце.

Числовая апертура, опять же, определяемая как N.A., является мерой того, насколько хорошо объектив микроскопа может собирать свет. Высокие НА объективы пропускают свет под косыми углами, в то время как низкие НА требуют более прямого света. Разрешающую способность объектива можно рассчитать по числовой апертуре, учитывая длину волны света.

Источник света, полевая диафрагма, апертура и конденсор отвечают за производство света и его доставку к образцу.

Источником света обычно является низковольтная галогенная лампа, которую можно регулировать для контроля интенсивности света.

Затем свет проходит через различные фильтры и попадает в полевую диафрагму, которая контролирует площадь освещаемого образца.

Далее идет конденсатор, который фокусирует яркий свет на образце, конус освещения вокруг образца контролируется конденсором и должен регулироваться в зависимости от используемого объектива.

Чтобы начать использовать световой микроскоп, поместите образец, содержащий интересующую область, на предметный столик микроскопа, центрируйте его непосредственно над объективом и закрепите на месте с помощью зажимов для предметного стекла.

Далее включите источник света и переключитесь на объектив с наименьшей мощностью.

Затем сфокусируйте маломощный объектив, переместив его в направлении z с помощью первоначальной регулировки ручки грубой регулировки, а затем вращайте ручки точной регулировки, чтобы сделать объект более четким. Будьте осторожны, чтобы не задеть объективом предметное стекло или предметную область, так как это может повредить объектив.

Затем найдите интересующую область, глядя через окуляры и регулируя ручки, чтобы перемещать предметное стекло в направлениях x и y. Размер поля зрения будет резко уменьшаться при переходе от малого увеличения к большему.

Центрирование объектива с самой низкой мощностью на области интереса перед переходом к более мощной значительно увеличивает шансы найти нужный образец.

После того как образец будет расположен на низком энергопотреблении и окажется в фокусе, перейдите к объективу с более высокой мощностью, который будет использоваться для получения изображений.

Оптимизируйте качество освещения, сначала отрегулировав диафрагму поля зрения так, чтобы сама диафрагма находилась за пределами поля зрения.

Далее отрегулируйте диафрагму конденсатора так, чтобы настройки соответствовали числовой апертуре используемого объектива.

Наконец, снова отрегулируйте фокус. На этот раз только с помощью ручки точной регулировки.

Теперь вы готовы к съемке образца.

Световая микроскопия обладает потенциалом для визуализации широкого спектра образцов, и существуют различные конфигурации составного микроскопа, подходящие для самых разных областей применения.

Здесь вы видите исследователя, готовящегося к работе под хирургическим микроскопом. Эти микроскопы, как правило, подвешиваются на подвижной руке и являются стереоскопическими, что означает, что они пропускают свет к зрителю, а также к камере, установленной на микроскопе. Этот хирургический микроскоп используется в процедуре трансплантации почки у мышей.

В этом клипе вы видите исследователя, смотрящего в препарирующий микроскоп, выбирая идеальных личинок дрозофилы для дальнейшего вскрытия, чтобы обнажить мышцы стенки тела и изучить нервно-мышечное соединение.

Здесь можно увидеть, как инвертированный составной микроскоп, у которого объектив находится под предметным столиком, подготавливается к технике микроинъекции. Эта процедура, известная как перенос ядра соматической клетки, является важным методом получения трансгенных животных и создания клонов.

Вы только что посмотрели введение JoVE в световую микроскопию.

В этом видео мы рассмотрели: что такое микроскоп и как он работает, из чего он состоит из множества компонентов, как в них вносить коррективы и как получать качественные изображения. Спасибо за просмотр!