Введение в световую микроскопию

Световой микроскоп представляет собой инструмент, используемый для увеличения исследуемых образцов. Световые микроскопы являются бесценным аналитическим инструментом, который позволяет исследователям рассматривать объекты с увеличением до 1000 раз по сравнению с их исходным размером. Как вы увидите, работа светового микроскопа основана на нескольких базовых принципах, однако он имеет практически неограниченные возможности применения для визуализации образцов в лаборатории.

Как следует из названия, для светового микроскопа требуется источник света, который излучает свет, фокусируемый конденсорной линзой на образец.

Свет, освещающий препарат, попадает в линзу, называемую объективом, которая создает увеличенное изображение, которое является инвертированным, то есть перевернутым. Окуляр дополнительно увеличивает изображение, которое затем воспринимается глазом. В световой путь могут быть введены дополнительные оптические элементы для выравнивания изображения, чтобы глаз видел его в правильной ориентации. Микроскопы, использующие несколько линз, подобные тому, что вы видите здесь, называются сложными (комбинированными) микроскопами.

В сложном микроскопе общее увеличение рассчитывается путем умножения увеличения объектива на увеличение окуляра. При использовании объектива 40X и окуляра 10X общее увеличение составляет 400X.

Для облегчения оценки размера объектов под микроскопом может использоваться окулярная измерительная шкала (ретикула) — шкала, которая проецируется на изображение. При более высоком увеличении деления окулярной шкалы будут соответствовать меньшим расстояниям, чем при просмотре при низком увеличении.

Помимо увеличения, другим аспектом оптики микроскопа является разрешение. Разрешение означает кратчайшее различимое расстояние между двумя объектами под микроскопом. По мере того как очертания этих символов становятся все более четкими и разрешение увеличивается, кратчайшее наблюдаемое расстояние между ними уменьшается.

Основные компоненты светового микроскопа включают объективы, окуляры, предметный столик и зажим для препарата, источник света, полевую диафрагму, конденсатор и апертурную диафрагму, а также ручки грубой и точной фокусировки.

Объективы обеспечивают основную часть увеличения и разрешающей способности микроскопа. Они установлены на вращающейся револьверной головке таким образом, что при смене объективов фокальная плоскость остается неизменной — это свойство называется парафокальностью. На объективе может быть указаны увеличение, числовая апертура (N.A.), тип требуемой иммерсионной среды, толщина покровного стекла, которая должна использоваться при подготовке образцов, и рабочее расстояние — расстояние от передней линзы объектива до фокальной плоскости в образце.

Числовая апертура, обозначаемая как N.A., является мерой способности объектива микроскопа собирать свет. Объективы с высокой N.A. пропускают свет, падающий под косыми углами, тогда как объективы с низкой N.A. требуют более прямого освещения. Разрешающая способность объектива может быть рассчитана на основе числовой апертуры при известной длине волны света.

Источник света, полевая диафрагма, апертурная диафрагма и конденсатор в совокупности отвечают за генерацию света и его подачу на образец.

Источником света обычно служит галогенная лампа низкого напряжения, интенсивность света которой можно регулировать.

Затем свет проходит через ряд фильтров в полевую диафрагму, которая определяет область освещения препарата.

Далее следует конденсатор, который фокусирует яркий свет на образце; конус освещения вокруг образца регулируется конденсатором и должен настраиваться в зависимости от используемого объектива.

Чтобы начать работу со световым микроскопом, поместите образец, содержащий интересующую область, на предметный столик микроскопа, отцентрируйте его точно под объективом и зафиксируйте с помощью зажимов столика.

Затем включите источник света и переключитесь на объектив с наименьшим увеличением.

Далее сфокусируйте объектив с малым увеличением, перемещая его по оси z с помощью предварительной настройки винтом грубой фокусировки, а затем вращайте винты тонкой фокусировки для достижения четкого изображения объекта. Будьте осторожны, чтобы объектив не задел предметное стекло или столик, так как это может повредить линзу.

Затем найдите интересующую область, глядя в окуляры и вращая ручки управления для перемещения предметного стекла по осям x и y. Размер поля зрения будет резко уменьшаться при переходе от малого увеличения к большему.

Центрирование области интереса при использовании объектива с наименьшим увеличением перед переходом к большему увеличению значительно повышает шансы найти нужный объект.

Как только образец будет найден при малом увеличении и сфокусирован, переключитесь на объектив с большим увеличением, который будет использоваться для получения изображений.

Оптимизируйте качество освещения, сначала отрегулировав полевую диафрагму так, чтобы сама диафрагма находилась непосредственно за пределами поля зрения.

Затем отрегулируйте диафрагму конденсатора так, чтобы ее настройки соответствовали числовой апертуре используемого объектива.

Наконец, снова настройте фокус, на этот раз используя только винт тонкой фокусировки.

Теперь вы готовы приступить к съемке вашего образца.

Световая микроскопия позволяет визуализировать широкий спектр образцов, и существуют различные конфигурации сложных микроскопов, подходящие для многих различных областей применения.

Здесь вы видите исследователя, который готовится к работе с хирургическим микроскопом. Такие микроскопы обычно подвешены на подвижном рычаге и являются стереоскопическими, что означает, что они обеспечивают прохождение света как к наблюдателю, так и к установленной на микроскопе камере. Данный хирургический микроскоп используется при процедуре трансплантации почки у мышей.

В этом клипе исследователь смотрит в диссекционный микроскоп, выбирая подходящих личинок drosophila для последующего препарирования с целью обнажения мышц стенки тела для изучения нервно-мышечных соединений.

Здесь представлен инвертированный сложный микроскоп, объектив которого расположен под предметным столиком; он подготавливается для проведения микроинъекции. Эта процедура, известная как перенос ядер соматических клеток, является важным методом получения трансгенных животных и создания клонов.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по световой микроскопии.

В этом видео мы рассмотрели: что представляет собой микроскоп и как он работает, его основные компоненты, способы их настройки, а также методы получения качественных изображений. Спасибо за просмотр!