Нецелевые Метаболомики из биологических источников Использование UltraPerformance жидкостной хроматографии высокого разрешения масс-спектрометрии (UPLC-HRMS)

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы сравнить снимки метаболических профилей различных групп биологических образцов. Это достигается за счет использования жидкостной, жидкой экстракции для разделения органических и полярных молекул. На втором этапе молекулы дополнительно разделяются с помощью жидкостной хроматографии и анализируются с помощью масс-спектрометрии с высоким разрешением, которая предоставляет данные о времени удержания, соотношении массы к заряду и интенсивности для дальнейшего анализа.

Следующие прогоны жидкостной хроматографии выравниваются, а признаки обнаруживаются, количественно оцениваются и сортируются. Для того, чтобы выявить дифференциально распространенные признаки между группами. Результаты показывают различия в характеристиках в разных условиях лечения на основе дифференциального содержания аналитов, обнаруженных с помощью жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии с высоким разрешением.

Хотя этот метод может быть использован для изучения клеточного метаболизма, он также может дать представление об открытии биомаркеров или метаболизме зенобиотических веществ. Для прилипших линий добавьте 1,5 миллилитра среды в ячейки в 10-сантиметровую пластину. Поставьте пластину на лед и аккуратно соскребите, чтобы приподнять ячейки.

Перенесите 1,5 миллилитра поднятой клеточной суспензии в предварительно маркированную стеклянную центрифужную пробирку объемом 10 миллилитров. Затем добавьте шесть миллилитров от двух до одного хлороформа метанола в каждую из 10-миллилитровых стеклянных пробирок, содержащих образцы. Встряхивайте образцы на низкой скорости в течение 30 минут После встряхивания центрифугируйте образцы с низким ускорением замедления при 1,935 умножении G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия для полного разделения фаз с помощью пастбищной пипетки с длинным стеблем.

Перенесите органический слой в новую предварительно маркированную стеклянную центрифужную пробирку объемом 10 миллилитров. Далее переложите водный слой в чистую пластиковую двухмиллилитровую эйноровую трубку. На этом этапе испаряют органические и водные образцы под действием газообразного азота.

Восстановите высушенные образцы в 50-100 микролитрах исходного раствора для желаемого метода UPLC. Аккуратно пипетируйте образец вверх и вниз, чтобы помочь растворению аналитов. Затем поместите каждый образец в нейлоновый трубчатый фильтр толщиной 0,22 микрона и вращайте до 14 000 G в течение примерно пяти минут, пока образец полностью не пройдет через фильтр.

Осмотрите образец, чтобы убедиться, что в образце не осталось видимых осадков. Переложите надосадочную жидкость отфильтрованного образца в предварительно маркированный флакон из ПЛК со вставной крышкой флакона. Затем проведите им, чтобы удалить пузыри со дна флакона с образцом.

Поместите образец в охлажденный автопробоотборник. Теперь создайте прогон для органического образца с помощью управляющего программного обеспечения для жидкостного хроматографа. После этого создайте прогон для органического образца на основе оптимизированных условий UPLC.

Используйте оптимизированные условия UPLC для создания метода и для водной фазы. Если известный набор целевых аналитов представляет большой интерес, оптимизируйте условия UPLC с использованием сильно меченого аналога этих соединений и сгенерируйте метод. Используя эти условия, позволяют СПЛК адекватно уравновешиваться.

Перед установкой колонны и следованием указаниям производителя по уравновешиванию объема новой колонки ведите журнал пускового противодавления, чтобы помочь диагностировать будущие проблемы с помощью управляющего программного обеспечения для масс-спектрометра с высоким разрешением. Создайте метод положительного режима. Затем, используя те же условия, создаем метод отрицательного режима.

Очистите и откалибруйте прибор. Обеспечьте стабильное распыление в спектрометре и дайте время калибровочному раствору адекватно рассеяться от источника и оптики. Приемлемая стабильность распыления должна давать относительное стандартное отклонение интенсивности от 3 до 5% в течение не менее 100 сканирований с впрыском калибровочного раствора с той же скоростью потока, что и при использовании метода lc.

С помощью генератора случайных чисел и ключа выборки настраиваются случайным образом, чтобы избежать каких-либо пакетных эффектов, вызванных анализом. Настройте последовательность для всех образцов. Установите соответствующий объем впрыска и запустите заготовку перед первым образцом.

При подозрении на перенос или матричные эффекты между образцами запустите соответствующие заготовки или промывки, начните последовательность и периодически отслеживайте проблемы, включая колебания давления или потерю интенсивности сигнала на протяжении всего прогона. При обнаружении серьезных проблем остановите пробег. Очистите и откалибруйте прибор.

Обеспечьте стабильное распыление в спектрометре и дайте время калибровочному раствору адекватно рассеяться от источника и оптики. Прежде чем приступить к дифференциальному анализу, вручную проверьте общие ионные токи или посмотрите на отфильтрованные хроматограммы на наличие любого известного соединения в образце. Чтобы обеспечить воспроизводимость прогонов и стабильность распыления UPLC для распыления методом распыления UPLC во всех образцах, перенесите файлы RAW данных с масс-спектрометра на жесткий диск рабочей станции, на которой установлено сито.

Откройте сито. Начните новый эксперимент и загрузите соответствующие файлы в сито. Назначьте группы сравнения и выберите один файл ссылки, чтобы SIE V могла генерировать параметры для анализа.

Следуйте подсказкам и корректируйте любые параметры в соответствии с требованиями любого отдельного эксперимента. Загрузите правильный список аддуктов для положительного или отрицательного режима в параметрах. После завершения анализа убедитесь, что на экране появился список кадров.

Убедитесь, что выравнивание lc накладывается на все контрольные вершины. Если какой-либо из невыровненных прогонов LC показывает большое отклонение в знаковых пиках. Это может свидетельствовать о проблеме с образцом.

Построение графика данных по коэффициенту вариации в аналогичной выборке генеральной совокупности. Отсортируйте список по желаемым чертам. Затем изучите каждый пик на предмет соответствующего выравнивания пиков между группами.

Интегрирование пиков, Гауссов, интенсивность сигнала пиковой формы, изотопы и назначение аддуктов. Экспортируйте данные по желанию для дальнейшего анализа или для создания целевых массовых списков для подтверждения и МС до конца экспериментов. Большое количество попаданий было идентифицировано двумя программами, используемыми для дифференциальных зеленых точек, которые более распространены в контроле, в то время как красные точки более распространены в обработке.

Больший размер точки указывает на увеличенную величину изменения кратности между группами, а интенсивность цвета демонстрирует уменьшение значения P с увеличением насыщенности изображенного цвета. Вот хроматограммы, показывающие органическую фазу положительного ионного режима, окно анализа UPLC MS A показывает общий ионный ток от S Civ 2.0. Извлеченная ионная хроматограмма для признака, идентифицированного XCMS как D paneth, отображается в окне B. В окне C отображается экстрагированная ионная хроматограмма для признака, идентифицированного как rot, известного из sve.

В окне D показана выделенная ионная хроматограмма для признака, идентифицированного как rot, известного из sve, нормализованного до общего ионного тока. Дифференциально распространенный признак, уменьшенный в группе известной гнили, обработанной гнилью, был предварительно идентифицирован как d. panadine с помощью тщательного массового поиска в базе данных. Идентичность аналита была подтверждена с помощью тандемной масс-спектрометрии U-P-L-C-H-R.

Здесь показано сравнение хроматограмм и масс-спектров образца и чистого соединения. Не забывайте, что работа с хлороформом может быть чрезвычайно опасной, поэтому следует соблюдать надлежащие меры предосторожности, такие как хорошо вентилируемый вытяжной шкаф.