Количественный Анализ по изучению белок: ДНК взаимодействий, Discover транскрипционных регуляторов экспрессии генов, и идентифицировать новые противоопухолевых средств

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать количественный анализ связывания ДНК, который полезен для изучения взаимодействий белковой ДНК, открытия транскрипционных регуляторов экспрессии генов и выявления новых противоопухолевых агентов. Это достигается путем предварительного получения аналитической пластины, покрытой стрептавидином, с подходящей мишенью БИОТИНИЛИРОВАННОЙ ДНК. Второй шаг заключается в добавлении белков ядерного экстракта с потенциальными ингибиторами или без них и позволяет им связываться с мишенью ДНК.

Далее связанные факторы транскрипции детектируются первичными антителами и вторичными антителами, связанными с пероксидазой хрена. Заключительным этапом является добавление в лунки субстрата пероксидазы хрена для того, чтобы вызвать развитие цвета. В конечном счете, развитие цвета измеряется с помощью спектрофотометра.

Со временем величина изменения цвета будет указывать на степень связывания ДНК и эффект потенциальных ингибиторов связывания ДНК. Основное преимущество этого метода перед другими методами, такими как анализ сдвига электрофоретической подвижности, заключается в том, что он представляет собой количественный анализ связывания ингибитора ДНК. Для начала необходимо подготовить достаточное количество клеточных культур, состоящих по меньшей мере из трех умножить на 10 до семи клеток для каждого тестируемого условия.

Здесь используются эндотелиальные клетки костного мозга человека, которые экспрессируют белок run X two. Как только клетки сливаются на 80%. Обрабатывайте клетки 0,2 мкг на миллилитр, без коназола, чтобы остановить рост клеток на границе клеточного цикла G-2M.

Это стабилизирует прогон белка X two и обеспечит максимальное связывание ДНК через 16 часов. Лизируйте клетки и выделите белок, как указано в сопроводительном текстовом протоколе. После того, как белок будет выделен, измерьте концентрацию белка с помощью стандартного анализа BCA.

Затем храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия в аликвотах по 10 микролитров с концентрацией от двух до пяти миллиграммов на миллилитр. Зафиксируйте 96-луночную пластину 0,1 молярным раствором карбоната натрия, добавив 300 микролитров смеси на пер. Хорошо подготовьтесь достаточно, чтобы каждый образец был запущен в трех экземплярах.

Выдержите пластину в течение двух часов на качающейся платформе при комнатной температуре. Затем трижды промойте планшет 300 микролитрами стрептококка и промойте буфер и инкубируйте со 100 микролитрами двухцепочечных олигонуклеотидов, меченных биотином, в концентрации 1,25 наномоля на лунку в течение двух часов, покачивая. Затем вымойте пластины еще три раза с помощью буфера для стирки strep din.

Затем добавьте 100 микролитров на лунку мастер-смеси, содержащей один XDNA-связывающий буфер, ДНК-связывающие белки в дозе от трех до девяти микрограммов на лунку и poly DIGC в дозе 1 микрограмм на лунку. Затем добавьте в соответствующие лунки исходную смесь, содержащую любой потенциальный ингибитор, такой как витамин D-3, или соответствующее разбавление растворителя, контролирующего растворитель, такой как этанол. Затем накройте пластину и поместите ее на качающуюся платформу при температуре четыре градуса Цельсия на ночь после инкубации с ядерными экстрактами.

Трижды промойте тарелку с помощью стрептококка и буфера для промывки. Затем добавьте 90 микролитров на лунку прогона X два специфических моноклональных антитела, разведенных до 0,2 нанограмма на микролитр и промывочного буфера. Накройте тарелку крышкой и выдержите ее при комнатной температуре на качающейся платформе в течение часа.

Затем снова промойте лунки стрептококковым и промывочным буфером и добавьте 90 микролитров на лунку вторичной смеси антител, содержащей пять нанограммов на микролитр fab специфического аффинного очищенного HRP-конъюгированного антитела, разведенного в стрептококке. AVID и буфер для стирки. Инкубируйте вторичное антитело в течение 30 минут при комнатной температуре на качающейся платформе.

Затем промойте его шесть раз с 300 микролитрами на лунку Strp и буфером для промывки. Затем обработайте результаты, добавив 50 микролитров субстрата тетраэтилбенадина в каждую лунку непосредственно из бутылочки со складом для непрерывного мониторинга образцов. Поместите образцы в спектрофотометр и непрерывно измеряйте поглощение на 635 нанометрах.

Для одноразового измерения образцы инкубируют от 10 до 20 минут при комнатной температуре в темноте. За это время лунки должны измениться от прозрачных до разной степени синего. Остановите реакцию, добавив в каждую по 50 микролитров серной кислоты.

Затем измерьте поглощение каждой лунки на 450 нанометрах с помощью 96-луночного планшетного ридера. Приведенный здесь график является примером непрерывного мониторинга влияния биологически активного витамина D 3 на связывание X 2D NA. Испытанные концентрации оказали незначительное влияние на связывание прогона X 2D NA.

Хотя было показано, что другие три соединения витамина D оказывают впечатляющее воздействие. Протестированное здесь соединение 5 2 2 1 9 7 5 было идентифицировано с помощью компьютерного дизайна лекарственных средств. При тестировании соединение продемонстрировало дозозависимое ингибирование связывания rux two с одного наномоляра до 100 микромоляров, 50% связывания renx 2D NA удалось ингибировать всего с 0,01 микромоля соединения.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как проводить анализ связывания ДНК и тестировать потенциальные ингибиторы связывания ДНК.