ПЦР: полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция или ПЦР представляет собой широко используемый метод амплификации фрагментов ДНК. В ПЦР применяется термоциклирование, которое заключается в многократном нагревании и охлаждении реакционной смеси при трех различных температурах, соответствующих стадиям денатурации, отжига и элонгации (достройки).

Реакция термоциклирования начинается после помещения реагентов для ПЦР в термоциклер — прибор, запрограммированный на точное нагревание и охлаждение реакционной смеси.

Цикл ПЦР начинается с денатурации, которая протекает в течение 20–30 секунд при 95 °C, что значительно выше температуры плавления ДНК. Температура плавления — это состояние, при котором половина ДНК представляет собой двухцепочечную спираль, а другая половина — одноцепочечный случайный клубок. Температура денатурации поддерживается значительно выше температуры плавления, чтобы гарантировать разрыв всех водородных связей между комплементарными парами оснований, в результате чего образуются только одноцепочечные ДНК. Пары одноцепочечных нитей называют смысловой (сенс) и антисмысловой (антисенс) нитями. Последовательность смысловой или кодирующей нити идентична последовательности мРНК, которая в конечном итоге кодирует белок. Таким образом, она является «смысловой». При чтении слева направо она начинается с 5’-фосфата и заканчивается 3’-гидроксилом. Антисмысловая нить также называется комплементарной нитью; при чтении слева направо она начинается с 3’-гидроксила и заканчивается 5’-фосфатом.

На втором этапе, отжиге, короткие фрагменты ДНК, называемые праймерами, которые специфичны для смысловой или антисмысловой нитей, связываются с ними посредством водородных связей. Праймер, который связывается с антисмысловой нитью и имеет ту же последовательность, что и смысловая нить, является прямым или сенс-праймером. Праймер, который связывается со смысловой нитью и имеет последовательность, обратную и комплементарную смысловой нити, является обратным или антисенс-праймером. В зависимости от длины используемых праймеров температура отжига на этом этапе обычно на 3–5 °C ниже более низкой температуры плавления двух ваших праймеров. Отжиг обычно происходит при температуре от 50 до 65 °C и длится от 20 до 40 секунд.

После связывания с ДНК праймеры инициируют реакцию, создавая свободную 3’-гидроксильную группу, к которой будет присоединяться полимераза — фермент, реплицирующий ДНК.

Следующий этап, называемый элонгацией или достройкой, происходит при 72 °C, что является оптимальной температурой для активности полимеразы. После связывания полимераза начинает поочередно добавлять свободные нуклеотидтрифосфаты (dNTP) к концам праймеров в направлении от 5’ к 3’ для синтеза двухцепочечной ДНК.

По завершении элонгации начинается следующий цикл. В следующем цикле праймеры связываются с одноцепочечной ДНК, образованной в ходе предыдущей достройки. Короткий фрагмент, который необходимо амплифицировать (ампликон), в конечном итоге образуется, когда полимераза достраивает цепь от прямого праймера на нити, которая была синтезирована путем амплификации от обратного праймера, или наоборот. После образования количество ампликонов будет увеличиваться экспоненциально в последующих циклах. В зависимости от цели вашей реакции потребуется от 20 до 40 циклов.

Для длинных ампликонов обычно проводится финальный этап элонгации при 72 °C в течение 5–15 минут, чтобы гарантировать, что вся ДНК стала двухцепочечной. Обычно в программу термоциклера закладывается финальный этап выдержки при 4 °C в качестве меры предосторожности, чтобы ДНК оставалась стабильной до извлечения из прибора.

Для проведения ПЦР-реакции требуется несколько ключевых реагентов. Во-первых, это матричная ДНК — образец ДНК, из которого будет амплифицирован ваш фрагмент. Затем требуются праймеры, представляющие собой короткие участки ДНК или олигонуклеотиды, которые инициируют реакцию полимеразы.

При выборе праймеров необходимо учитывать несколько важных факторов. Во-первых, они должны быть комплементарны 5’- и 3’-областям матричной ДНК, фланкирующим последовательность, которую необходимо амплифицировать. Во-вторых, их длина должна составлять от 15 до 30 пар оснований, а содержание гуанинов и цитозинов — около 50%. В-третьих, температуры плавления обоих праймеров должны быть выше 50 °C и различаться не более чем на один-два градуса, чтобы они могли эффективно связываться при одной и той же температуре отжига. В-четвертых, праймеры не должны быть комплементарны друг другу, чтобы не образовывались димеры праймеров. И в-пятых, они не должны образовывать вторичных структур, возникающих в результате самоотжига внутри одного праймера.

Помимо праймеров и матричной ДНК, для ПЦР-реакции необходима ДНК-полимераза. Ферментом, наиболее часто используемым в ПЦР, является Taq-полимераза — термостабильный фермент, выделенный из бактерии Thermus aquaticus, которая обитает в горячих источниках. Taq-полимераза выдерживает температуры выше 90 °C.

В реакционную смесь также должны быть добавлены dNTP, которые станут парами оснований в растущих цепях. Реакционный буфер, поддерживающий pH и содержащий важные ионы, такие как марганец, магний и калий, также является необходимым компонентом, который стабилизирует реакцию и обеспечивает полимеразу важными кофакторами. Как и для любой реакции, для ПЦР требуется растворитель, поэтому используется вода степени чистоты для ПЦР, очищенная от ионов, способных ингибировать реакцию.

Перед началом ПЦР убедитесь, что рабочая среда чиста, чтобы избежать контаминации. Обязательно используйте перчатки.

Для удобства контроля за различными компонентами реакции, которые вам понадобятся, составьте таблицу объемов и концентраций реагентов для каждого вашего образца, включая контроли. Что касается объемов, типичная реакция должна содержать 5μL 10X реакционного буфера, 4μL 25 mM MgCl2, 1μL dNTPs в концентрации 10 mM, 2μL прямого и обратного праймеров в концентрации 50 ng/μL и 0.3μL Taq-полимеразы в концентрации 5 U/μL. Добавьте достаточное количество матрицы, чтобы в реакции присутствовало 100 ng. Наконец, большинство ПЦР-реакций проводят в общем объеме 50μL. Таким образом, необходимо добавить определенный объем воды для ПЦР, чтобы обеспечить итоговый объем в 50μL.

После того как вы спланировали реакцию на бумаге, подготовьте реагенты на льду.

Затем добавьте реагенты в ПЦР-пробирку. Сначала добавьте воду, затем матрицу, праймеры, буфер, хлорид магния и dNTPs; Taq-полимеразу добавьте в последнюю очередь и тщательно перемешайте.

После подготовки реакции поместите образец в термоциклер и запустите программу ПЦР. Вкратце, основные части прибора состоят из термоблока, куда вставляется ПЦР-пробирка или планшет и где происходят точные изменения температуры; нагреваемой крышки, которая предотвращает конденсацию, чтобы образец не терялся; и интерфейса с дисплеем для программирования температуры ПЦР и продолжительности циклов. Всегда настраивайте программу перед сборкой реакционной смеси.

После завершения работы термоциклера извлеките вашу реакционную смесь и проверьте ПЦР-продукт с помощью гель-электрофореза. Если ПЦР прошла успешно, вы должны увидеть ампликон правильного размера по количеству пар оснований.

А теперь несколько полезных советов по работе с ПЦР. Когда вам необходимо амплифицировать один и тот же ПЦР-продукт из нескольких различных матриц, что требует подготовки большого количества реакций, удобно увеличить объем реакции для создания мастер-микса. ПЦР мастер-микс представляет собой смесь всех общих для образцов реагентов в большом объеме, которая затем распределяется по нескольким пробиркам для реакции.

Большинство ПЦР-реакций начинаются с этапа начальной денатурации, которая проходит при 95°C в течение 1–9 минут. Этот этап гарантирует, что вся матрица станет одноцепочечной перед первым циклом амплификации.

Зачастую, при высоком риске контаминации образца, целесообразно использовать специальный бокс для ПЦР. Для проверки реакции на наличие загрязнений полезно установить отрицательный контроль, который не содержит матрицы ДНК и не должен давать продукта при электрофорезе ДНК-геля.

Часто ПЦР требует оптимизации путем корректировки температуры, концентрации хлорида магния или подбора новых праймеров. После того как ПЦР заработает, рекомендуется всегда использовать матрицу положительного контроля, которая гарантированно дает продукт.

Существует множество модификаций и вариантов применения ПЦР для различных целей.

Один из таких вариантов, ПЦР с «горячим стартом» (hot start PCR), предполагает удерживание полимеразы в неактивном состоянии до завершения первого этапа денатурации, что предотвращает неспецифическую амплификацию, которая может возникнуть перед началом циклов.

Метод ПЦР также может быть модифицирован для одновременной амплификации нескольких последовательностей ДНК путем использования нескольких праймеров в одной ПЦР-реакции; этот метод называется мультиплексной ПЦР.

В сочетании с флуоресцентными олигонуклеотидными зондами ПЦР может стать методом измерения относительного или абсолютного уровня экспрессии генов или количества мРНК, синтезируемой для конкретного гена или группы генов. Этот метод называют кПЦР (qPCR).

ПЦР также может использоваться для определения наличия определенной последовательности ДНК в организме. Эта процедура называется генотипированием. Например, генотипирование может применяться для проверки подлинности образцов рыбы путем выявления наличия в образце видоспецифической последовательности. Генотипирование также используется в судебной экспертизе для установления соответствия ДНК, обнаруженной на месте преступления, ДНК подозреваемого.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по ПЦР. В этом ролике мы рассмотрели, что представляет собой ПЦР и как она работает, изучили многочисленные компоненты ПЦР-реакции, механизм, с помощью которого ПЦР амплифицирует ДНК, а также множество модификаций и вариантов применения этого крайне полезного метода. Спасибо за просмотр!