ПЦР: полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция или ПЦР является широко используемым методом амплификации фрагментов ДНК. В ПЦР используется термоциклирование, которое представляет собой повторный нагрев и охлаждение реакции с помощью трех различных температур, называемых денатурацией, отжигом и растяжением или удлинением.

Реакция термоциклирования начинается после того, как реагенты для ПЦР помещаются в термоамплификатор — машину, которая запрограммирована на точный нагрев и охлаждение реакции.

Цикл ПЦР начинается с денатурации, которая происходит в течение 20-30 секунд при температуре 95 °C, что значительно выше температуры плавления ДНК. Температура плавления — это состояние, при котором половина ДНК представляет собой двухцепочечную спираль, а другая — одноцепочечную случайную спираль. Температура денатурации значительно превышает температуру плавления, чтобы гарантировать, что все водородные связи между комплементарными парами оснований разрываются с образованием только одноцепочечных ДНК. Парные одиночные нити называются смысловыми и антисмысловыми нитями. Последовательность чувственной, или кодирующей цепи, идентична последовательности мРНК, которая в конечном итоге будет кодировать белок. Поэтому в этом есть смысл. При чтении слева направо он начинается с 5'-фосфата и заканчивается 3'-гидроксилом. Антисмысловая цепь также называется комплементарной цепью и начинается с 3'-гидроксила и заканчивается 5'-фосфатом при чтении слева направо.

На втором этапе, отжиге, короткие участки ДНК, называемые праймерами, которые специфичны для чувственных или антисмысловых нитей, связываются с помощью водородных связей. Праймер, который связывается с антисмысловой цепью и имеет ту же последовательность, что и смысловая цепь, является прямым или смысловым праймером. Праймер, который связывается с чувствительной цепью и имеет последовательность, которая является обратной и комплементарной смысловой цепи, является вашим обратным или антисмысловым праймером. В зависимости от длины используемых грунтовок температура отжига на этом этапе обычно на 3-5 °C ниже нижней температуры плавления двух грунтовок. Отжиг обычно происходит при температуре от 50 до 65 °C и длится от 20 до 40 секунд.

Как только праймеры связываются с ДНК, они запускают реакцию, создавая конец 3'-гидроксильной группы, с которым будет связываться полимераза, фермент, который реплицирует ДНК.

Следующий этап, называемый удлинением или растяжением, происходит при 72 °C, что является оптимальным для активности полимеразы. После связывания полимераза начинает добавлять свободные нуклеотидтрифосфаты, или дНТФ, к концам праймера по одному в направлении от 5' до 3' для создания двухцепочечной ДНК.

Как только удлинение завершается, начинается следующий цикл. В следующем цикле праймеры будут связываться с одноцепочечной ДНК, образованной в результате предыдущего удлинения. Короткий фрагмент, который вы пытаетесь амплифицировать, ампликон, в конечном итоге образуется, когда полимераза распространяется от прямого праймера на цепь, которая была получена путем амплификации из обратного праймера или наоборот. После генерации количество ампликона будет увеличиваться экспоненциально в последующих циклах. В зависимости от цели вашей реакции, потребуется от 20 до 40 циклов.

Для длинных ампликонов заключительный этап удлинения обычно выполняется при температуре 72 °C в течение 5-15 минут, чтобы убедиться, что вся ДНК является двухцепочечной. Как правило, заключительный этап удержания при температуре 4 °C программируется в термоамплификаторе в качестве меры предосторожности, чтобы гарантировать, что ДНК остается стабильной до тех пор, пока она не будет извлечена из термоамплификатора.

Для проведения ПЦР-реакции требуется несколько ключевых реагентов. Во-первых, это шаблон ДНК, который представляет собой образец ДНК, из которого будет амплифицирован ваш фрагмент. Кроме того, есть праймеры, которые представляют собой короткие кусочки ДНК или олигонуклеотидов, которые запускают полимеразную реакцию.

Есть несколько важных соображений, которые необходимо учитывать при выборе грунтовок. Во-первых, они должны быть комплементарны 5'- и 3'-участкам вашей матрицы ДНК, которые фланкируют последовательность, которую вы хотите амплифицировать. Во-вторых, они должны иметь длину от 15 до 30 пар оснований и состоять примерно на 50% из гуанинов и цитозинов. В-третьих, температура плавления обоих грунтовок должна быть выше 50 °C и находиться в пределах одного-двух градусов друг от друга, чтобы они могли эффективно связываться при одинаковой температуре отжига. В-четвертых, они не могут дополнять друг друга и образовывать димеры грунтовки. И в-пятых, они не должны содержать вторичной структуры, которая формируется путем самоотжига внутри одного из грунтов.

В дополнение к праймерам и ДНК-матрице, ДНК-полимераза необходима для ПЦР-реакции. Ферментом, наиболее часто используемым в ПЦР, является Taq-полимераза, которая представляет собой термостабильный фермент, выделенный из бактерии Thermus aquaticus, которая обитает в горячих источниках. Taq-полимераза может выдерживать температуру выше 90 °C.

В реакцию также должны быть добавлены dNTP, которые будут содержать пары оснований в растущих цепях. Реакционный буфер, который поддерживает pH и содержит важные ионы, такие как марганец, магний и калий, также является необходимым компонентом реакции, который стабилизирует реакцию и обеспечивает важные кофакторы для фермента полимеразы. Как и для всех реакций, для ПЦР требуется растворитель, поэтому используется вода для ПЦР, которая не содержит ионов, которые могут ингибировать реакцию.

Перед началом ПЦР убедитесь, что рабочая среда чистая, чтобы избежать загрязнения. Перчатки необходимо надевать всегда.

Чтобы помочь с отслеживанием различных компонентов реакции, которые вам понадобятся. Составьте таблицу объемов и концентраций реагентов для каждого из ваших образцов, включая контроль. С точки зрения объемов, типичная реакция должна содержать 5 мкл 10X реакционного буфера, 4 мкл 25 мМ MgCl2, 1 мкл dNTP при 10 мМ, 2 мкл прямых и обратных праймеров при концентрации 50 нг/мкл и 0,3 мкл Taq-полимеразы при концентрации 5 ЕД/мкл. Вы хотите добавить достаточное количество шаблона, чтобы в реакции присутствовало 100 нг. Наконец, большинство реакций ПЦР проводится в общем объеме 50 мкл. Таким образом, необходимо использовать объем воды для ПЦР, чтобы убедиться, что общий объем действительно составляет 50 мкл.

После того, как ваша реакция спланирована на бумаге, соберите реагенты на льду.

Затем добавьте свои реагенты в ПЦР-пробирку. Сначала добавьте воду, затем шаблон, праймеры, буфер, хлорид магния и dNTP, в последнюю очередь добавьте Taq-полимеразу и тщательно перемешайте.

После того, как реакция настроена, поместите образец в амплификатор и запустите программу ПЦР. Вкратце, части машины состоят из термоблока, куда вставляется ПЦР-пробирка или планшет и подвергается точным изменениям температуры. Крышка с подогревом, которая предотвращает конденсацию, чтобы образец не терялся, и интерфейс с дисплеем для программирования температуры ПЦР и продолжительности цикла. Всегда настраивайте свою программу перед сборкой реакции.

Как только термоамплификатор выполнит свою работу. Выньте свою реакцию и проверьте продукт ПЦР с помощью гель-электрофореза. Если ПЦР прошла успешно, вы должны увидеть ампликон с правильным размером пары оснований.

А теперь несколько полезных советов по работе с ПЦР. Когда вы пытаетесь амплифицировать один и тот же продукт PCR из нескольких разных шаблонов и, следовательно, у вас много разных реакций на настройку. Полезно масштабировать реакцию для создания мастер-микса. Мастер-смесь для ПЦР представляет собой смесь большого объема всех реагентов, совместно используемых в образцах, которая затем распределяется по нескольким реакционным пробиркам.

Большинство реакций ПЦР начинаются с начального этапа денатурации, который происходит при температуре 95°C в течение 1–9 минут. Этот шаг гарантирует, что весь шаблон является одноцепочечным для первого цикла усиления.

Часто желательно использовать шкаф для ПЦР, когда риск загрязнения вашего образца высок. Чтобы проверить наличие каких-либо загрязнений в вашей реакции, полезно установить отрицательный контроль, который не имеет матрицы ДНК и не должен производить продукт в вашем геле ДНК.

Часто ПЦР необходимо оптимизировать, регулируя температуру, концентрацию хлорида магния или пробуя новые праймеры. Как только ваш ПЦР сработает. Хорошей идеей будет всегда запускать шаблон положительного контроля, который, как вы знаете, приведет к созданию продукта.

Существует множество вариаций и применений ПЦР для различных целей.

Один из вариантов ПЦР, ПЦР с горячим запуском, включает в себя удержание полимеразы в реакции до окончания первой стадии денатурации, что предотвращает неспецифическую амплификацию, которая может произойти перед циклом.

ПЦР также может быть модифицирована для одновременной амплификации нескольких последовательностей ДНК путем использования нескольких праймеров в одной реакции ПЦР, называемой мультиплексной ПЦР.

В сочетании с флуоресцентными олигонуклеотидными зондами ПЦР может фактически стать методом, который может измерять относительные или абсолютные уровни экспрессии генов или сколько мРНК производится для данного гена или группы генов. Этот метод называется количественной ПЦР.

ПЦР также может быть использована для определения наличия определенной последовательности ДНК в организме. Эта процедура называется генотипированием. Например, генотипирование может быть использовано для определения подлинности образцов рыбы путем выяснения того, присутствует ли в образце видоспецифичная последовательность. Генотипирование также используется в судебно-медицинской экспертизе, чтобы определить, соответствует ли ДНК, найденная на месте преступления, подозреваемому.

Вы только что посмотрели введение JoVE в ПЦР. В этом видео мы рассмотрели, что такое ПЦР и как она работает, многие компоненты ПЦР-реакции, механизм, с помощью которого ПЦР может амплифицировать ДНК, а также множество вариаций и применений этого очень полезного метода. Спасибо за просмотр!