Основные методы клеточной и молекулярной биологии

Многие биомедицинские эксперименты требуют манипуляций с точно известным количеством клеток для получения точных, воспроизводимых и статистически значимых данных. Таким образом, умение подсчитывать клетки является крайне важным навыком для любого успешного биомедика. Наиболее распространенным способом подсчета клеток является использование гемоцитометра — прибора с двумя выгравированными лазером сетками, которые облегчают подсчет аликвоты клеток под обычным световым микроскопом. Эти данные...

Линии клеток часто используются в биомедицинских экспериментах, поскольку они позволяют быстро культивировать и наращивать популяции типов клеток для экспериментального анализа. Линии клеток культивируются в условиях, схожих с условиями для свежевыделенных или первичных клеток, однако существуют некоторые важные базовые различия: (i) линиям клеток требуются собственные специфические коктейли факторов роста и (ii) за их ростом необходимо следить более внимательно, чем за первичными клетками, так...

Полимеразная цепная реакция, или ПЦР, представляет собой метод амплификации ДНК с помощью термоциклирования — циклов изменения температуры через фиксированные интервалы времени. Используя термостабильную ДНК-полимеразу, ПЦР позволяет создавать многочисленные копии ДНК из строительных блоков ДНК, называемых dNTP. В ПЦР предусмотрено  три этапа: денатурация, отжиг и элонгация. Денатурация является первым этапом цикла и вызывает плавление ДНК путем разрыва водородных связей между основаниями, в...

Гель-электрофорез ДНК — это метод, используемый для обнаружения и разделения молекул ДНК. К гелевой матрице, состоящей из агарозы, прикладывается электрическое поле, в результате чего заряженные частицы внутри геля мигрируют и разделяются в зависимости от размера. Отрицательно заряженные фосфаты остова ДНК заставляют фрагменты ДНК двигаться к аноду — положительно заряженному электроду. В видео объясняется механизм разделения фрагментов ДНК в агарозном геле, а также приводится общая пошаговая...

Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, или SDS-PAGE, представляет собой широко используемый метод разделения смесей белков исключительно по их размеру. Додецилсульфат натрия (SDS), анионный детергент, используется для создания равномерного заряда по всей длине линеаризованных белков. После их нанесения на гель из полиакриламида и приложения к нему электрического поля происходит разделение белков, покрытых SDS. Электрическое поле служит движущей силой,...

Трансформация — это процесс, при котором клетка поглощает чужеродную ДНК из окружающей среды. В природе трансформация может происходить у определенных типов бактерий. В молекулярной биологии трансформация воспроизводится искусственно в лабораторных условиях путем создания пор в мембранах бактериальных клеток. Бактериальные клетки, способные поглощать ДНК из окружающей среды, называются компетентными клетками. В лабораторных условиях бактериальные клетки можно сделать компетентными с последующим...

Термин «трансформация» означает поглощение клеткой чужеродной ДНК. В природе трансформация может происходить у определенных типов бактерий. Однако в молекулярной биологии трансформация индуцируется искусственно путем создания пор в клеточных стенках бактерий. Бактериальные клетки, способные поглощать ДНК из окружающей среды, называются компетентными клетками. Электрокомпетентные клетки могут быть получены в лаборатории, и трансформация таких клеток может быть достигнута путем воздействия...

ИФА (иммуноферментный анализ) обычно проводится для обнаружения присутствия и/или определения количества целевого белка в экспериментальном образце. Обнаружение целевого белка становится возможным благодаря антителам, что делает ИФА иммунохимическим анализом. В ходе серии стадий инкубации и промывки эти антитела, которые часто связаны с ферментом (конъюгированы), обнаруживают белок, покрывающий дно лунки микротитрационного планшета. При добавлении субстрата связанный с антителом фермент...

Очистка плазмид — это метод, используемый для выделения и очистки плазмидной ДНК от геномной ДНК, белков, рибосом и клеточной стенки бактерий. Плазмида представляет собой небольшую кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК, которая служит носителем специфических фрагментов ДНК. При введении в организм хозяина посредством трансформации плазмида реплицируется, создавая многочисленные копии исследуемого фрагмента ДНК. В данном видео представлено пошаговое обобщенное описание процедуры очистки плазмид.

Гелевая очистка используется для выделения фрагментов ДНК после электрофоретического разделения. Выделение ДНК из агарозного геля включает три основных этапа: связывание, промывку и элюцию из силикационной колонки. Считается, что в присутствии высокой концентрации соли ДНК связывается с силикагелем посредством солевого мостика. После связывания ДНК очищается от примесей путем промывки и элюируется в условиях низкой ионной силы, что приводит к разрыву этого взаимодействия. В данном видео...

Вестерн-блоттинг используется для идентификации специфических белков в электрофоретически разделенных образцах. После разделения методом, известным как электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), проводят вестерн-перенос белков из полиакриламидного геля на мембрану, которая фиксирует белки в их соответствующих положениях. Затем мембраны инкубируют с антителами в процессе, называемом иммуноблоттингом. Иммуноблоттинг основан на связывании антитело-белок и...

Трансфекция представляет собой процесс введения генетического материала, такого как DNA и двухцепочечная RNA, в клетки млекопитающих. Введение DNA в клетку позволяет осуществлять экспрессию, или синтез, белков с использованием собственных механизмов клетки, в то время как введение RNA в клетку используется для подавления продукции специфического белка путем остановки трансляции. В то время как место действия трансфецированной RNA — цитоплазма, для эффективной трансфекции DNA должна быть...

В молекулярной биологии лигация представляет собой соединение двух фрагментов ДНК посредством образования фосфодиэфирной связи. Реакцию лигации катализирует фермент, называемый лигазой. В клетке лигазы восстанавливают одно- и двухцепочечные разрывы, возникающие в процессе репликации ДНК. В лабораторных условиях ДНК-лигаза используется при молекулярном клонировании для соединения фрагментов вставок с векторами — молекулами ДНК-носителями, которые обеспечивают репликацию целевых фрагментов в...

Рестриктазы или эндонуклеазы распознают и разрезают ДНК в определенной последовательности. Эти ферменты естественным образом встречаются в бактериях и служат защитой от бактериофагов — вирусов, поражающих бактерии. Бактериальные рестриктазы разрезают ДНК внедряемого бактериофага, при этом геномная ДНК бактерии остается неповрежденной благодаря присоединению метильных групп. В этом видео объясняются основные принципы работы рестриктаз, в том числе: правила именования рестриктаз, а также типы...

Молекулярное клонирование представляет собой набор методов, используемых для вставки рекомбинантной ДНК в вектор — носитель молекул ДНК, который обеспечивает репликацию фрагментов рекомбинантной ДНК в организмах-хозяевах. Фрагмент ДНК, которым может быть ген, может быть выделен из прокариотического или эукариотического образца. После выделения интересующего фрагмента (вставки) и вектор, и вставка должны быть расщеплены рестрикционными ферментами и очищены. Очищенные фрагменты соединяются с...