Электрофорез в ДНК-геле

Гель-электрофорез ДНК — это метод, используемый для разделения и идентификации фрагментов ДНК в зависимости от размера.

Фрагменты ДНК различного размера загружаются в пористый гель, изготовленный из агарозы – углевода, содержащегося в красных водорослях.

При приложении электрического поля фрагменты будут мигрировать через гель благодаря отрицательно заряженным фосфатным группам в нуклеотидах ДНК.

Более мелкие участки ДНК будут легче мигрировать через гель, чем более крупные фрагменты, которым труднее перемещаться через гелевую матрицу.

Когда прогон геля завершен, местоположение образцов ДНК можно сравнить с серией фрагментов или полос известных размеров, называемых лестницей ДНК.

Наличие интересующего фрагмента может быть подтверждено на основе его размера, который определяется путем сравнения относительного расположения вашего тестового образца с фрагментами лестницы.

Агарозные гели готовятся с использованием раствора в процентном соотношении массы к объему. Так что из 1 грамма агарозы в 100 мл буфера получится 1% гель. Более низкий процент гелей лучше разрешает более крупные фрагменты, а более высокий процент гелей облегчает идентификацию более мелких фрагментов. Чтобы начать процедуру изготовления геля, отвесьте соответствующую массу агарозы в колбу Эрленмейера.

Добавьте в колбу бегущий буфер так, чтобы объем буфера не превышал 1/3 емкости колбы. Затем перемешайте, чтобы перемешать.

Растопите агарозно-буферную смесь, нагрев в микроволновой печи на максимальной мощности. Каждые тридцать секунд вынимайте колбу и перемешивайте содержимое, чтобы хорошо перемешать. Повторяйте до тех пор, пока агароза полностью не растворится.

Затем добавьте бромид этидия в концентрации 0,5 мг/мл. Бромид этидии представляет собой ароматическое соединение, которое помещается между отдельными парами оснований ДНК, или интеркалатами, и заставляет ДНК излучать интенсивную оранжевую флуоресценцию под воздействием ультрафиолетового излучения. Важно отметить, что бромид этидии является канцерогеном, поэтому при работе с гелями, содержащими это соединение, всегда следует надевать перчатки.

Чтобы лоток для геля не деформировался, дайте агарозе остыть, поместив ее на водяную баню с температурой 65ºC.

По мере остывания агарозы подготовьте форму для геля, поместив лоток с гелем в литейный аппарат. В качестве альтернативы вы можете использовать ленту для герметизации открытых краев лотка для геля, чтобы создать форму. Помещение гребня в гель создает лунки, в которые загружается ДНК. Убедитесь, что расческа создаст лунку, размер которой соответствует вашему образцу ДНК.

Вылейте расплавленный агароз в форму для геля и дайте ему застыть при комнатной температуре.

После того как агароза застынет, выньте гребень. Если гель не будет использоваться сразу, заверните его в пищевую пленку и храните при температуре 4ºC до использования.

Если гель будет использован сразу, поместите его в коробку с гелем.

Чтобы начать эту процедуру, добавьте гелеобразующий краситель к образцам ДНК, которые нужно разделить. Загрузка красителя обычно производится в концентрации в 6 раз. Загрузка красителя помогает визуализировать и загружать образцы в скважины, а также помогает определить, насколько далеко образцы мигрировали во время прогона.

Установите блок питания на нужное напряжение.

Теперь добавьте в гелевую коробку достаточное количество буфера для бега, чтобы покрыть поверхность геля. Убедитесь, что вы используете тот же буфер для работы, который использовался для приготовления геля.

Подключите выводы гелевой коробки к источнику питания и включите его. Помните, что ДНК отрицательно заряжена и будет двигаться к аноду, который является положительным и, как правило, красного цвета. Убедитесь, что черный провод или катод не подсоединяются к дну гелевой коробки. Чтобы вы не забыли, имейте в виду, что черные кошки — это невезение, или негатив, и поэтому черный кошка отрицательный. Нанесите гель на красный цвет или анод. Убедиться в работоспособности гелевой коробки и блока питания; Появление пузырьков на электродах говорит о том, что через них проходит ток.

Снимите крышку коробки с гелем. Медленно и осторожно загрузите образцы ДНК в гель. Опять же, загружаемый краситель в образце позволяет образцу погрузиться в гель и поможет отследить, как далеко прошел образец. Маркер размера ДНК, или лестница, всегда должен быть загружен вместе с экспериментальными образцами.

Установите крышку на место. Убедитесь, что электроды вставлены в правильные слоты в блоке питания.

Включите питание. Наносите гель до тех пор, пока краситель не отойдет на соответствующее расстояние.

Когда запуск электрофореза будет завершен, выключите электропитание и снимите крышку гелевой коробки.

Извлеките гель из коробки с гелем и слейте излишки буфера с поверхности геля. Поместите лоток для геля на бумажные полотенца, чтобы впитать остатки бегущего буфера.

Чтобы визуализировать фрагменты ДНК, извлеките гель из лотка с гелем и подвергните гель воздействию ультрафиолетового света.

Фрагмент ДНК должен отображаться в виде оранжевых флуоресцентных полос. Сфотографируйте гель.

В конце эксперимента правильно утилизируйте гель и буфер в соответствии с правилами учреждения. Опять же, не забывайте всегда обращаться с гелем и буферами в перчатках, чтобы избежать воздействия бромида этидия.

Теперь, когда вы узнали, как провести электрофорез в ДНК-геле. Давайте рассмотрим некоторые последующие приложения и вариации этого очень полезного метода.

Здесь вы видите результат электрофореза в агарозном геле после разделения продуктов ПЦР. Фрагменты ДНК, загруженные в гель, видны в виде четко очерченных полос. Стандарт ДНК или лестница должны быть разделены до такой степени, чтобы можно было эффективно определить размеры полос образца. В этом примере фрагменты ДНК из 765 пар оснований, 880 пар оснований и 1022 пар оснований разделены на 1,5% агарозном геле с помощью 2-логарифмической лестницы ДНК.

Помимо подтверждения наличия интересующего фрагмента ДНК, гель-электрофорез ДНК можно сочетать с процедурами очищения гелем. Как правило, лезвие бритвы используется для вырезания интересующего фрагмента ДНК, чтобы его можно было собрать и восстановить образец ДНК внутри него.

Электрофезис в агарозном геле также можно сочетать с трансфер-блоттингом, который включает в себя перенос ДНК или РНК на целлюлозную мембрану, где радиоактивные зонды могут быть использованы для идентификации конкретных последовательностей ДНК или РНК в образце, разделенном электрофоретически.

Стандартный гель-электрофорез ДНК не идеален для разделения высокомолекулярной ДНК размером более 15-20 кб, как геномная ДНК. Для разделения больших образцов ДНК используется гель-электрофорез импульсного поля, который включает в себя воздействие на гель изменяющегося, или пульсирующего, электрического поля в разных направлениях. Этот метод включает в себя специализированное устройство для бега геля, которое имеет пары электродов, расположенных в разных направлениях вокруг геля. Это может быть использовано для обнаружения различий в размерах генома между популяциями организмов, например, объединенные образцы ДНК из разных микробных сообществ, которые взяты из разных озерных сред.

Вы только что ознакомились с электрофорезом в ДНК-геле. Мы показали вам концепцию метода, как приготовить агарозный гель, как загрузить образцы, как запустить гель и проанализировать его, а также некоторые распространенные применения электрофореза в агарозном геле. Спасибо за просмотр и удачи в запуске вашего геля.