Гель-электрофорез ДНК

Гель-электрофорез ДНК — это метод, используемый для разделения и идентификации фрагментов ДНК в зависимости от их размера.

Фрагменты ДНК различных размеров вносятся в пористый гель из агарозы — углевода, который содержится в красных водорослях.

При подаче электрического поля фрагменты мигрируют через гель благодаря отрицательно заряженным фосфатным группам в нуклеотидах ДНК.

Малые фрагменты ДНК мигрируют через гель легче, чем более крупные фрагменты, которым труднее перемещаться сквозь матрикс геля.

По завершении электрофореза положение образцов ДНК можно сравнить с серией фрагментов или полос известных размеров, называемых маркером молекулярной массы (ДНК-лестницей).

Наличие интересующего фрагмента затем подтверждается на основании его размера, который определяется путем сравнения относительного положения исследуемого образца и фрагментов маркера.

Агарозные гели готовят, используя раствор с процентным содержанием по массе на объем. Таким образом, 1 г агарозы в 100 мл буфера позволит получить 1% гель. Гели с более низким процентом содержания агарозы лучше разделяют крупные фрагменты, а гели с более высоким процентом облегчают идентификацию более мелких фрагментов. Для начала процедуры приготовления геля отвесьте необходимое количество агарозы в колбу Эрленмейера.

Добавьте в колбу электрофоретический буфер так, чтобы объем буфера не превышал 1/3 объема колбы. Затем перемешайте содержимое круговыми движениями.

Расплавьте смесь агарозы и буфера, нагревая ее в микроволновой печи на максимальной мощности. Каждые тридцать секунд вынимайте колбу и осторожно перемешивайте содержимое. Повторяйте процедуру до полного растворения агарозы.

Затем добавьте бромистый этидий до достижения концентрации 0.5 mg/ml. Бромистый этидий представляет собой ароматическое соединение, которое встраивается между отдельными парами оснований ДНК (интеркалирует), заставляя ДНК испускать интенсивную оранжевую флуоресценцию под воздействием УФ-излучения. Важно отметить, что бромистый этидий является канцерогеном, поэтому при работе с гелями, содержащими это соединение, необходимо всегда использовать перчатки.

Чтобы предотвратить деформацию лотка для геля, охладите агарозу, поместив ее в водяную баню при 65ºC.

Пока агароза охлаждается, подготовьте форму для геля, поместив лоток в устройство для отливки. В качестве альтернативы можно использовать клейкую ленту для герметизации открытых краев лотка с целью создания формы. Установка гребенки в гель создает лунки, в которые вносится ДНК. Убедитесь, что гребенка сформирует лунку подходящего размера для вашего образца ДНК.

Залейте расплавленную агарозу в форму для геля и дайте ей затвердеть при комнатной температуре.

После затвердевания агарозы извлеките гребенку. Если гель не будет использоваться немедленно, оберните его пищевой пленкой и храните при 4ºC до использования.

Если гель будет использоваться немедленно, поместите его в камеру для электрофореза.

Для начала процедуры добавьте краситель для нанесения в образцы ДНК, которые необходимо разделить. Краситель для нанесения обычно готовится в концентрации 6X. Он позволяет визуализировать образцы при внесении их в лунки, а также определить расстояние, на которое они мигрировали в ходе электрофореза.

Установите на блоке питания необходимое напряжение.

Залейте в камеру для электрофореза достаточное количество рабочего буфера, чтобы он полностью покрывал поверхность геля. Убедитесь, что используете тот же рабочий буфер, который применялся при подготовке геля.

Подключите электроды камеры к блоку питания и включите его. Помните, что ДНК заряжена отрицательно и будет двигаться к аноду, который имеет положительный заряд и обычно обозначен красным цветом. Следите за тем, чтобы черный провод, или катод, не был подключен к нижней части камеры. Чтобы не перепутать, запомните, что черные кошки приносят неудачу, то есть имеют «отрицательный» знак, и черный КАТод (cathode), соответственно, отрицателен. Направляйте движение образцов в геле к красному электроду, то есть к аноду. Чтобы убедиться в исправности камеры и блока питания, проверьте наличие пузырьков у электродов, что указывает на прохождение тока.

Снимите крышку камеры. Медленно и аккуратно внесите образцы ДНК в гель. Как уже упоминалось, краситель в образце позволяет ему осесть в лунке и помогает отслеживать фронт миграции. Вместе с опытными образцами всегда следует наносить маркер размеров ДНК (лестницу).

Закройте крышку. Еще раз проверьте, правильно ли подключены электроды к соответствующим разъемам блока питания.

Включите питание. Проводите электрофорез до тех пор, пока краситель не мигрирует на необходимое расстояние.

По завершении электрофореза выключите источник питания и снимите крышку камеры для геля.

Извлеките гель из камеры и слейте излишки буфера с его поверхности. Положите лоток с гелем на бумажные полотенца, чтобы удалить остатки рабочего буфера.

Для визуализации фрагментов ДНК извлеките гель из лотка и подвергните его воздействию ультрафиолетового света.

Фрагменты ДНК должны проявиться в виде оранжевых флуоресцентных полос. Сфотографируйте гель.

По окончании эксперимента утилизируйте гель и рабочий буфер надлежащим образом в соответствии с правилами вашего учреждения. Еще раз напоминаем, что при работе с гелем и рабочими буферами всегда следует использовать перчатки, чтобы избежать воздействия бромистого этидия.

Теперь, когда вы ознакомились с тем, как проводить гель-электрофорез ДНК, давайте рассмотрим некоторые последующие применения и модификации этого крайне полезного метода.

Здесь представлен результат электрофореза в агарозном геле после разделения продуктов ПЦР. Фрагменты ДНК, нанесенные на гель, видны в виде четко выраженных полос. Стандарт ДНК или маркер длин должен быть разделен до такой степени, чтобы можно было точно определить размер полос образцов. В данном примере фрагменты ДНК размером 765 base pairs, 880 base pairs и 1022 base pairs разделены в 1.5% агарозном геле с использованием 2-log DNA ladder.

Помимо подтверждения наличия интересующего фрагмента ДНК, гель-электрофорез ДНК может сочетаться с процедурами очистки из геля. Обычно для вырезания интересующего фрагмента ДНК используется лезвие бритвы, после чего фрагмент собирается, а образец ДНК из него восстанавливается.

Электрофорез в агарозном геле также может быть совмещен с трансфером (блоттингом), который заключается в переносе ДНК или РНК на целлюлозную мембрану, где радиоактивные зонды могут быть использованы для идентификации специфических последовательностей ДНК или РНК в электрофоретически разделенном образце.

Стандартный гель-электрофорез ДНК не является идеальным для разделения высокомолекулярной ДНК размером более 15-20 kb, такой как геномная ДНК. Для разделения крупных образцов ДНК используется электрофорез в пульсирующем поле, который предполагает воздействие на гель изменяющимся или пульсирующим электрическим полем, направленным в разные стороны. Эта техника требует использования специального аппарата для электрофореза, в котором пары электродов расположены в разных ориентациях вокруг геля. Данный метод может быть использован для выявления различий в размерах геномов между популяциями организмов, например, в объединенных образцах ДНК из различных микробных сообществ, которые вы видите здесь, взятых из разных озерных сред.

Вы только что ознакомились с введением в гель-электрофорез ДНК. Мы представили концепцию данного метода, показали, как подготовить агарозный гель, как наносить образцы, проводить электрофорез, анализировать результаты, а также рассмотрели некоторые основные области применения агарозного гель-электрофореза. Спасибо за просмотр и успехов в проведении ваших экспериментов.