Разделение белков методом SDS-PAGE
SDS-PAGE — это метод, используемый многими исследователями для разделения смесей белков по размеру. Успешное выполнение этой процедуры является важным первым этапом для многих методов анализа белков, таких как иммуноблоттинг. Сам по себе этот метод служит полезным инструментом для оценки размера и чистоты белков.
Чтобы разобраться в методе SDS-PAGE, необходимо сначала понять его основные компоненты. SDS-PAGE расшифровывается как электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Додецилсульфат натрия, первая часть этого термина, или «SDS», представляет собой анионный детергент. Это означает, что он состоит из гидрофильной группы с чистым отрицательным зарядом и длинной гидрофобной цепи с нейтральным зарядом.
Гидрофобная цепь обволакивает белки пропорционально их массе со скоростью 1,4 грамма SDS на грамм белка. Это придает белкам движущую силу, необходимую для разделения по размеру в электрическом поле.
Электрофорез в полиакриламидном геле использует гидрогель на основе полиакриламида. Полиакриламид — это полимер, образующий очень регулярную матрицу, через которую могут перемещаться белки. Чем выше концентрация геля, тем медленнее белки будут проходить сквозь него под воздействием электрического поля. Процесс использования пространственно однородного электрического поля для воздействия на движение объекта называется электрофорезом.
SDS-PAGE проводят для белков, выделенных из многих различных источников, включая культивируемые клетки, ткани, кровь, мочу и дрожжи.
Белки из этих различных источников должны быть предварительно отделены от других клеточных компонентов с помощью таких методов, как гомогенизация и центрифугирование, после чего часто используют лизирующие буферы.
После выделения белка часто измеряют его концентрацию, чтобы обеспечить равную загрузку образцов, сравнивая количество белка в образце со стандартами альбумина в колориметрическом анализе с использованием бицинхониновой кислоты (BCA-анализ).
Важным этапом, о котором следует помнить, является добавление буфера для нанесения образцов. Буфер для нанесения выполняет три основные функции. Во-первых, благодаря SDS и дополнительным восстановителям он денатурирует белки, что фактически означает превращение сложных белковых структур в линейную цепь аминокислот. Во-вторых, он содержит глицерин, который гарантирует, что образец не всплывет при нанесении в лунки геля. И, наконец, большинство коммерческих буферов для нанесения включают краситель, такой как бромфеноловый синий, по которому можно отслеживать ход процесса электрофореза.
После добавления буфера для нанесения образцы необходимо перемешать, а затем кипятить в течение 5 минут. Это позволяет разрушить прочные дисульфидные связи в белках с помощью восстановителя, такого как бета-меркаптоэтанол. После разрыва всех дисульфидных связей SDS может более равномерно обволакивать белки.
Затем образцы быстро центрифугируют (спин-даун), после чего они готовы к нанесению в гелевую систему для электрофореза.
Перед нанесением образцов необходимо собрать систему для электрофореза. Сначала приобретают или изготавливают полиакриламидный гель. Готовые гели становятся все более популярными, поскольку акриламид нейротоксичен и может вызвать повреждение головного мозга. Кассета с гелем содержит лунки, которые используются для нанесения образцов.
После фиксации гелей внутреннюю и внешнюю камеры заполняют буфером, содержащим ту же концентрацию ионов, которая использовалась при приготовлении гелей. Это создает электрическую цепь, которая беспрепятственно проходит от катода через гель к аноду.
Затем в гель обычно наносят маркеры молекулярной массы, после чего наносят образцы. По мере протекания электрофореза маркер разделяется, образуя видимые полосы белков известного размера. На заключительных этапах эти полосы можно использовать для расчета размера каждого белка.
После нанесения всех образцов положительный и отрицательный выводы на камере для электрофореза подключают к источнику питания, способному поддерживать постоянное напряжение в течение длительного времени. Электрофорез обычно начинают при напряжении около 60V, пока весь образец не войдет в область геля, называемую «стакирующим гелем». Затем напряжение увеличивают примерно до 200V на 30 минут или 1 час, в зависимости от размера и концентрации геля, а также размера интересующего белка.
По завершении электрофореза кассету извлекают и открывают, чтобы получить доступ к гелю. Затем гель можно окрасить типичным красителем для белков, таким как кумасси синий или серебро, чтобы визуализировать белковые полосы в геле. Окрашивание кумасси позволяет обнаруживать полосы, содержащие всего 50 nanograms белка, в то время как окрашивание серебром позволяет обнаруживать полосы с содержанием белка всего 1 nanogram.
При двумерном электрофорезе в геле образцы разделяются по двум различным свойствам на гелях, последовательно по одному измерению. Сначала образцы наносят и распределяют в соответствии с их изоэлектрическими точками на полосках с локализованным градиентом pH. Затем белки в полоске денатурируют и помещают на поверхность обычного полиакриламидного геля, где их фиксируют свежим раствором геля. После этого проводится разделение во втором измерении методом SDS-PAGE.
Хотя изоэлектрическое фокусирование не является единственным вариантом для 2-D электрофореза в геле, оно является наиболее распространенным. Двумерный электрофорез в геле — неоценимый инструмент, позволяющий получить представление о белковых комплексах и организации субклеточных структур.
После проведения электрофореза очень распространенным следующим шагом является перенос белков из геля на мембрану из PVDF или нейлона для последующего анализа. Затем можно использовать специфические антитела для зондирования мембраны и поиска интересующих белков. Здесь показаны типичные результаты иммуноблоттинга, в которых исследователь использовал три различных метода усиления сигнала, чтобы определить, какой из них лучше всего демонстрирует наличие белка Pit-1 в серии разведений.
Вы только что посмотрели видео JoVE о разделении белков с помощью SDS-PAGE. Теперь вы должны понимать этапы разделения белков по размеру с использованием этого эффективного метода. Как всегда, спасибо за просмотр!
Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, или SDS-PAGE, представляет собой широко используемый метод разделени…
SDS-PAGE — это метод, используемый многими исследователями для разделения смесей белков по размеру. Успешное выполнение этой процедуры является важным первым этапом для многих методов анализа белков, таких как иммуноблоттинг. Сам по себе этот метод служит полезным инструментом для оценки размера и чистоты белков.
Чтобы разобраться в методе SDS-PAGE, необходимо сначала понять его основные компоненты. SDS-PAGE расшифровывается как электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Додецилсульфат натрия, первая часть этого термина, или «SDS», представляет собой анионный детергент. Это означает, что он состоит из гидрофильной группы с чистым отрицательным зарядом и длинной гидрофобной цепи с нейтральным зарядом.
Гидрофобная цепь обволакивает белки пропорционально их массе со скоростью 1,4 грамма SDS на грамм белка. Это придает белкам движущую силу, необходимую для разделения по размеру в электрическом поле.
Электрофорез в полиакриламидном геле использует гидрогель на основе полиакриламида. Полиакриламид — это полимер, образующий очень регулярную матрицу, через которую могут перемещаться белки. Чем выше концентрация геля, тем медленнее белки будут проходить сквозь него под воздействием электрического поля. Процесс использования пространственно однородного электрического поля для воздействия на движение объекта называется электрофорезом.
SDS-PAGE проводят для белков, выделенных из многих различных источников, включая культивируемые клетки, ткани, кровь, мочу и дрожжи.
Белки из этих различных источников должны быть предварительно отделены от других клеточных компонентов с помощью таких методов, как гомогенизация и центрифугирование, после чего часто используют лизирующие буферы.
После выделения белка часто измеряют его концентрацию, чтобы обеспечить равную загрузку образцов, сравнивая количество белка в образце со стандартами альбумина в колориметрическом анализе с использованием бицинхониновой кислоты (BCA-анализ).
Важным этапом, о котором следует помнить, является добавление буфера для нанесения образцов. Буфер для нанесения выполняет три основные функции. Во-первых, благодаря SDS и дополнительным восстановителям он денатурирует белки, что фактически означает превращение сложных белковых структур в линейную цепь аминокислот. Во-вторых, он содержит глицерин, который гарантирует, что образец не всплывет при нанесении в лунки геля. И, наконец, большинство коммерческих буферов для нанесения включают краситель, такой как бромфеноловый синий, по которому можно отслеживать ход процесса электрофореза.
После добавления буфера для нанесения образцы необходимо перемешать, а затем кипятить в течение 5 минут. Это позволяет разрушить прочные дисульфидные связи в белках с помощью восстановителя, такого как бета-меркаптоэтанол. После разрыва всех дисульфидных связей SDS может более равномерно обволакивать белки.
Затем образцы быстро центрифугируют (спин-даун), после чего они готовы к нанесению в гелевую систему для электрофореза.
Перед нанесением образцов необходимо собрать систему для электрофореза. Сначала приобретают или изготавливают полиакриламидный гель. Готовые гели становятся все более популярными, поскольку акриламид нейротоксичен и может вызвать повреждение головного мозга. Кассета с гелем содержит лунки, которые используются для нанесения образцов.
После фиксации гелей внутреннюю и внешнюю камеры заполняют буфером, содержащим ту же концентрацию ионов, которая использовалась при приготовлении гелей. Это создает электрическую цепь, которая беспрепятственно проходит от катода через гель к аноду.
Затем в гель обычно наносят маркеры молекулярной массы, после чего наносят образцы. По мере протекания электрофореза маркер разделяется, образуя видимые полосы белков известного размера. На заключительных этапах эти полосы можно использовать для расчета размера каждого белка.
После нанесения всех образцов положительный и отрицательный выводы на камере для электрофореза подключают к источнику питания, способному поддерживать постоянное напряжение в течение длительного времени. Электрофорез обычно начинают при напряжении около 60V, пока весь образец не войдет в область геля, называемую «стакирующим гелем». Затем напряжение увеличивают примерно до 200V на 30 минут или 1 час, в зависимости от размера и концентрации геля, а также размера интересующего белка.
По завершении электрофореза кассету извлекают и открывают, чтобы получить доступ к гелю. Затем гель можно окрасить типичным красителем для белков, таким как кумасси синий или серебро, чтобы визуализировать белковые полосы в геле. Окрашивание кумасси позволяет обнаруживать полосы, содержащие всего 50 nanograms белка, в то время как окрашивание серебром позволяет обнаруживать полосы с содержанием белка всего 1 nanogram.
При двумерном электрофорезе в геле образцы разделяются по двум различным свойствам на гелях, последовательно по одному измерению. Сначала образцы наносят и распределяют в соответствии с их изоэлектрическими точками на полосках с локализованным градиентом pH. Затем белки в полоске денатурируют и помещают на поверхность обычного полиакриламидного геля, где их фиксируют свежим раствором геля. После этого проводится разделение во втором измерении методом SDS-PAGE.
Хотя изоэлектрическое фокусирование не является единственным вариантом для 2-D электрофореза в геле, оно является наиболее распространенным. Двумерный электрофорез в геле — неоценимый инструмент, позволяющий получить представление о белковых комплексах и организации субклеточных структур.
После проведения электрофореза очень распространенным следующим шагом является перенос белков из геля на мембрану из PVDF или нейлона для последующего анализа. Затем можно использовать специфические антитела для зондирования мембраны и поиска интересующих белков. Здесь показаны типичные результаты иммуноблоттинга, в которых исследователь использовал три различных метода усиления сигнала, чтобы определить, какой из них лучше всего демонстрирует наличие белка Pit-1 в серии разведений.
Вы только что посмотрели видео JoVE о разделении белков с помощью SDS-PAGE. Теперь вы должны понимать этапы разделения белков по размеру с использованием этого эффективного метода. Как всегда, спасибо за просмотр!
SDS-PAGE — это метод, используемый многими исследователями для разделения смесей белков по размеру. Успешное выполнение этой процедуры является важным первым этапом для многих методов анализа белков, таких как иммуноблоттинг. Сам по себе этот метод служит полезным инструментом для оценки размера и чистоты белков.
Чтобы разобраться в методе SDS-PAGE, необходимо сначала понять его основные компоненты. SDS-PAGE расшифровывается как электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Додецилсульфат натрия, первая часть этого термина, или «SDS», представляет собой анионный детергент. Это означает, что он состоит из гидрофильной группы с чистым отрицательным зарядом и длинной гидрофобной цепи с нейтральным зарядом.
Гидрофобная цепь обволакивает белки пропорционально их массе со скоростью 1,4 грамма SDS на грамм белка. Это придает белкам движущую силу, необходимую для разделения по размеру в электрическом поле.
Электрофорез в полиакриламидном геле использует гидрогель на основе полиакриламида. Полиакриламид — это полимер, образующий очень регулярную матрицу, через которую могут перемещаться белки. Чем выше концентрация геля, тем медленнее белки будут проходить сквозь него под воздействием электрического поля. Процесс использования пространственно однородного электрического поля для воздействия на движение объекта называется электрофорезом.
SDS-PAGE проводят для белков, выделенных из многих различных источников, включая культивируемые клетки, ткани, кровь, мочу и дрожжи.
Белки из этих различных источников должны быть предварительно отделены от других клеточных компонентов с помощью таких методов, как гомогенизация и центрифугирование, после чего часто используют лизирующие буферы.
После выделения белка часто измеряют его концентрацию, чтобы обеспечить равную загрузку образцов, сравнивая количество белка в образце со стандартами альбумина в колориметрическом анализе с использованием бицинхониновой кислоты (BCA-анализ).
Важным этапом, о котором следует помнить, является добавление буфера для нанесения образцов. Буфер для нанесения выполняет три основные функции. Во-первых, благодаря SDS и дополнительным восстановителям он денатурирует белки, что фактически означает превращение сложных белковых структур в линейную цепь аминокислот. Во-вторых, он содержит глицерин, который гарантирует, что образец не всплывет при нанесении в лунки геля. И, наконец, большинство коммерческих буферов для нанесения включают краситель, такой как бромфеноловый синий, по которому можно отслеживать ход процесса электрофореза.
После добавления буфера для нанесения образцы необходимо перемешать, а затем кипятить в течение 5 минут. Это позволяет разрушить прочные дисульфидные связи в белках с помощью восстановителя, такого как бета-меркаптоэтанол. После разрыва всех дисульфидных связей SDS может более равномерно обволакивать белки.
Затем образцы быстро центрифугируют (спин-даун), после чего они готовы к нанесению в гелевую систему для электрофореза.
Перед нанесением образцов необходимо собрать систему для электрофореза. Сначала приобретают или изготавливают полиакриламидный гель. Готовые гели становятся все более популярными, поскольку акриламид нейротоксичен и может вызвать повреждение головного мозга. Кассета с гелем содержит лунки, которые используются для нанесения образцов.
После фиксации гелей внутреннюю и внешнюю камеры заполняют буфером, содержащим ту же концентрацию ионов, которая использовалась при приготовлении гелей. Это создает электрическую цепь, которая беспрепятственно проходит от катода через гель к аноду.
Затем в гель обычно наносят маркеры молекулярной массы, после чего наносят образцы. По мере протекания электрофореза маркер разделяется, образуя видимые полосы белков известного размера. На заключительных этапах эти полосы можно использовать для расчета размера каждого белка.
После нанесения всех образцов положительный и отрицательный выводы на камере для электрофореза подключают к источнику питания, способному поддерживать постоянное напряжение в течение длительного времени. Электрофорез обычно начинают при напряжении около 60V, пока весь образец не войдет в область геля, называемую «стакирующим гелем». Затем напряжение увеличивают примерно до 200V на 30 минут или 1 час, в зависимости от размера и концентрации геля, а также размера интересующего белка.
По завершении электрофореза кассету извлекают и открывают, чтобы получить доступ к гелю. Затем гель можно окрасить типичным красителем для белков, таким как кумасси синий или серебро, чтобы визуализировать белковые полосы в геле. Окрашивание кумасси позволяет обнаруживать полосы, содержащие всего 50 nanograms белка, в то время как окрашивание серебром позволяет обнаруживать полосы с содержанием белка всего 1 nanogram.
При двумерном электрофорезе в геле образцы разделяются по двум различным свойствам на гелях, последовательно по одному измерению. Сначала образцы наносят и распределяют в соответствии с их изоэлектрическими точками на полосках с локализованным градиентом pH. Затем белки в полоске денатурируют и помещают на поверхность обычного полиакриламидного геля, где их фиксируют свежим раствором геля. После этого проводится разделение во втором измерении методом SDS-PAGE.
Хотя изоэлектрическое фокусирование не является единственным вариантом для 2-D электрофореза в геле, оно является наиболее распространенным. Двумерный электрофорез в геле — неоценимый инструмент, позволяющий получить представление о белковых комплексах и организации субклеточных структур.
После проведения электрофореза очень распространенным следующим шагом является перенос белков из геля на мембрану из PVDF или нейлона для последующего анализа. Затем можно использовать специфические антитела для зондирования мембраны и поиска интересующих белков. Здесь показаны типичные результаты иммуноблоттинга, в которых исследователь использовал три различных метода усиления сигнала, чтобы определить, какой из них лучше всего демонстрирует наличие белка Pit-1 в серии разведений.
Вы только что посмотрели видео JoVE о разделении белков с помощью SDS-PAGE. Теперь вы должны понимать этапы разделения белков по размеру с использованием этого эффективного метода. Как всегда, спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What does SDS do to proteins in SDS-PAGE?
SDS is an anionic detergent that coats proteins uniformly at a rate of 1.4 grams per gram of protein. This coating provides a consistent negative charge across the protein's length, enabling size-driven separation in an electric field. The detergent essentially linearizes complex protein structures, allowing them to migrate based solely on their molecular weight.
Q2: Why is the loading buffer important in SDS-PAGE preparation?
The loading buffer serves three critical functions: it denatures proteins into linear amino acid chains using SDS and reducing agents, it contains glycerin to prevent samples from floating out of gel wells, and it includes a dye like bromophenol blue to track electrophoresis progress. Boiling samples for 5 minutes with the buffer breaks disulfide bonds, allowing SDS to coat proteins evenly.
Q3: How does polyacrylamide gel concentration affect protein separation?
The polyacrylamide gel forms a regular matrix through which proteins migrate when exposed to an electric field. Higher gel concentrations create denser matrices that slow protein movement, while lower concentrations allow faster migration. This property enables researchers to optimize separation conditions based on the size of proteins being analyzed.
Q4: What is the purpose of molecular weight ladders in SDS-PAGE?
Molecular weight ladders are protein standards of known sizes loaded alongside samples. As the gel runs, ladder proteins spread and create visible bands at predictable positions. These reference bands allow researchers to calculate the exact size of unknown proteins in their samples by comparing their migration distances.
Q5: How do Coomassie and silver stains differ in protein detection?
Both stains visualize protein bands after electrophoresis, but they differ in sensitivity. Coomassie blue can detect protein bands containing as little as 50 nanograms, while silver stain is more sensitive, detecting bands with as little as 1 nanogram. Silver stain provides greater detection capability for low-abundance proteins.
Q6: What is two-dimensional gel electrophoresis and how does it work?
Two-dimensional gel electrophoresis separates proteins by two distinct properties sequentially. First, samples are arranged by isoelectric point on pH gradient strips, then proteins are transferred to a polyacrylamide gel where SDS-PAGE separation occurs. This dual approach provides insights into protein complexes and sub-organelle organization that single-dimension methods cannot reveal.
Q7: What happens after SDS-PAGE gel electrophoresis is complete?
After electrophoresis, the gel cassette is opened and the gel is stained with protein stains like Coomassie blue or silver stain to visualize protein bands. A common next step is transferring proteins from the gel onto a PVDF or nylon membrane for western blotting western transfer antibody detection analysis using specific antibodies to identify proteins of interest.
Browse More Videos
Главы в этом видео
0:00
Overview
0:29
Principal Components of the SDS-PAGE System
1:55
SDS-PAGE Sample Preparation
3:40
Loading and Running the Gel
5:18
Applications
7:07
Summary