Разделение белков методом SDS-PAGE

SDS-PAGE — это метод, используемый многими исследователями для разделения смесей белков по размеру. Успешное выполнение этой процедуры является важным первым этапом для многих методов анализа белков, таких как иммуноблоттинг. Сам по себе этот метод служит полезным инструментом для оценки размера и чистоты белков.

Чтобы разобраться в методе SDS-PAGE, необходимо сначала понять его основные компоненты. SDS-PAGE расшифровывается как электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Додецилсульфат натрия, первая часть этого термина, или «SDS», представляет собой анионный детергент. Это означает, что он состоит из гидрофильной группы с чистым отрицательным зарядом и длинной гидрофобной цепи с нейтральным зарядом.

Гидрофобная цепь обволакивает белки пропорционально их массе со скоростью 1,4 грамма SDS на грамм белка. Это придает белкам движущую силу, необходимую для разделения по размеру в электрическом поле.

Электрофорез в полиакриламидном геле использует гидрогель на основе полиакриламида. Полиакриламид — это полимер, образующий очень регулярную матрицу, через которую могут перемещаться белки. Чем выше концентрация геля, тем медленнее белки будут проходить сквозь него под воздействием электрического поля. Процесс использования пространственно однородного электрического поля для воздействия на движение объекта называется электрофорезом.

SDS-PAGE проводят для белков, выделенных из многих различных источников, включая культивируемые клетки, ткани, кровь, мочу и дрожжи.

Белки из этих различных источников должны быть предварительно отделены от других клеточных компонентов с помощью таких методов, как гомогенизация и центрифугирование, после чего часто используют лизирующие буферы.

После выделения белка часто измеряют его концентрацию, чтобы обеспечить равную загрузку образцов, сравнивая количество белка в образце со стандартами альбумина в колориметрическом анализе с использованием бицинхониновой кислоты (BCA-анализ).

Важным этапом, о котором следует помнить, является добавление буфера для нанесения образцов. Буфер для нанесения выполняет три основные функции. Во-первых, благодаря SDS и дополнительным восстановителям он денатурирует белки, что фактически означает превращение сложных белковых структур в линейную цепь аминокислот. Во-вторых, он содержит глицерин, который гарантирует, что образец не всплывет при нанесении в лунки геля. И, наконец, большинство коммерческих буферов для нанесения включают краситель, такой как бромфеноловый синий, по которому можно отслеживать ход процесса электрофореза.

После добавления буфера для нанесения образцы необходимо перемешать, а затем кипятить в течение 5 минут. Это позволяет разрушить прочные дисульфидные связи в белках с помощью восстановителя, такого как бета-меркаптоэтанол. После разрыва всех дисульфидных связей SDS может более равномерно обволакивать белки.

Затем образцы быстро центрифугируют (спин-даун), после чего они готовы к нанесению в гелевую систему для электрофореза.

Перед нанесением образцов необходимо собрать систему для электрофореза. Сначала приобретают или изготавливают полиакриламидный гель. Готовые гели становятся все более популярными, поскольку акриламид нейротоксичен и может вызвать повреждение головного мозга. Кассета с гелем содержит лунки, которые используются для нанесения образцов.

После фиксации гелей внутреннюю и внешнюю камеры заполняют буфером, содержащим ту же концентрацию ионов, которая использовалась при приготовлении гелей. Это создает электрическую цепь, которая беспрепятственно проходит от катода через гель к аноду.

Затем в гель обычно наносят маркеры молекулярной массы, после чего наносят образцы. По мере протекания электрофореза маркер разделяется, образуя видимые полосы белков известного размера. На заключительных этапах эти полосы можно использовать для расчета размера каждого белка.

После нанесения всех образцов положительный и отрицательный выводы на камере для электрофореза подключают к источнику питания, способному поддерживать постоянное напряжение в течение длительного времени. Электрофорез обычно начинают при напряжении около 60V, пока весь образец не войдет в область геля, называемую «стакирующим гелем». Затем напряжение увеличивают примерно до 200V на 30 минут или 1 час, в зависимости от размера и концентрации геля, а также размера интересующего белка.

По завершении электрофореза кассету извлекают и открывают, чтобы получить доступ к гелю. Затем гель можно окрасить типичным красителем для белков, таким как кумасси синий или серебро, чтобы визуализировать белковые полосы в геле. Окрашивание кумасси позволяет обнаруживать полосы, содержащие всего 50 nanograms белка, в то время как окрашивание серебром позволяет обнаруживать полосы с содержанием белка всего 1 nanogram.

При двумерном электрофорезе в геле образцы разделяются по двум различным свойствам на гелях, последовательно по одному измерению. Сначала образцы наносят и распределяют в соответствии с их изоэлектрическими точками на полосках с локализованным градиентом pH. Затем белки в полоске денатурируют и помещают на поверхность обычного полиакриламидного геля, где их фиксируют свежим раствором геля. После этого проводится разделение во втором измерении методом SDS-PAGE.

Хотя изоэлектрическое фокусирование не является единственным вариантом для 2-D электрофореза в геле, оно является наиболее распространенным. Двумерный электрофорез в геле — неоценимый инструмент, позволяющий получить представление о белковых комплексах и организации субклеточных структур.

После проведения электрофореза очень распространенным следующим шагом является перенос белков из геля на мембрану из PVDF или нейлона для последующего анализа. Затем можно использовать специфические антитела для зондирования мембраны и поиска интересующих белков. Здесь показаны типичные результаты иммуноблоттинга, в которых исследователь использовал три различных метода усиления сигнала, чтобы определить, какой из них лучше всего демонстрирует наличие белка Pit-1 в серии разведений.

Вы только что посмотрели видео JoVE о разделении белков с помощью SDS-PAGE. Теперь вы должны понимать этапы разделения белков по размеру с использованием этого эффективного метода. Как всегда, спасибо за просмотр!