Бактериальная трансформация: метод теплового шока

Бактериальная трансформация — это широко используемый метод введения чужеродной ДНК в бактериальную клетку, которая затем может амплифицировать или клонировать эту ДНК. Клетки, способные легко поглощать такую ДНК, называют компетентными клетками. Хотя трансформация естественным образом происходит у многих типов бактерий, ученые нашли способы искусственно индуцировать и повышать компетентность бактериальных клеток. В этом видео мы обсудим один из таких способов — трансформацию методом теплового шока.

Прежде чем перейти к технике теплового шока, давайте обсудим тип ДНК, который чаще всего используется при бактериальной трансформации: плазмиду. Плазмида представляет собой небольшую кольцевую двухцепочечную ДНК, которая может уменьшать свой размер за счет суперскручивания, что позволяет ей легко проходить через поры в клеточной мембране.

Плазмида содержит несколько важных областей, о которых стоит упомянуть. Коммерчески доступные плазмиды содержат полилинкер или MCS (multiple cloning site). Эта область содержит специфические последовательности, распознаваемые рестрикционными эндонуклеазами или рестриктазами, которые расщепляют ДНК. Фрагменты ДНК, представляющие интерес для исследователя, могут быть вставлены в полилинкер, если плазмида и фрагмент ДНК разрезаны одними и теми же эндонуклеазами.

Плазмиды также содержат точку начала репликации, или ORI (Origin of Replication), которая дает клетке информацию о том, где должна начаться репликация плазмиды.

Помимо точки начала репликации и полилинкера, большинство плазмид содержат ген устойчивости к антибиотикам. Этот ген обеспечивает устойчивость к антибиотикам всех клеток, содержащих плазмиду, что позволяет этим клеткам выживать в средах, содержащих антибиотик.

Теперь, когда мы обсудили плазмиды, давайте поговорим о клетках, в которые они будут введены: компетентных клетках. Наиболее часто используемым типом бактерий в исследованиях по молекулярной биологии и трансформации является E. coli, которая также обитает в вашем нижнем отделе кишечника. Клетки обычно делают компетентными путем воздействия среды, богатой кальцием.

Положительные заряды ионов кальция нейтрализуют отрицательные заряды как плазмиды, так и клеточной стенки бактерий, устраняя электростатическое отталкивание и ослабляя клеточную стенку.

При воздействии на клетки резкого повышения температуры, или теплового шока, создается разница давлений между внешней и внутренней сторонами клетки, что индуцирует образование пор, через которые может проникнуть суперскрученная плазмидная ДНК. После возвращения клеток к нормальной температуре клеточная стенка восстанавливается самостоятельно.

После того как клетки поглотили плазмиду, они смогут расти на агарных плашках с добавлением антибиотика.

Перед началом трансформации методом теплового шока очистите рабочую область и убедитесь, что все оборудование стерильно.

Убедитесь, что подготовлено достаточное количество сред и агара, обеспечивающих питание бактерий, которые вы будете делать компетентными. Также обязательно стерилизуйте все растворы путем автоклавирования. Дайте жидким средам остыть до комнатной температуры перед использованием, а агару — до 50-55˚C; при этой температуре можно добавлять антибиотик и разливать среду по чашкам. Дайте чашкам остыть до комнатной температуры для затвердевания.

При работе с бактериями всегда следует использовать асептическую технику для поддержания стерильности. Асептическая техника обычно предполагает использование горелки Бунзена для стерилизации инструментов и реагентов, а также для создания конвекционного потока, который предотвращает попадание загрязнителей из воздуха в рабочую зону.

Непосредственно перед реакцией теплового шока доведите среды до комнатной температуры, а чашки с LB-агаром, содержащим антибиотик, — до 37°C. Также убедитесь, что температура водяной бани составляет 42°C.

Затем разморозьте химически компетентные клетки на льду.

Добавьте 1-5uL холодной плазмиды в концентрации 1ng/μL к бактериальным клеткам, осторожно перемешайте и верните смесь клеток и плазмиды на лед на 30 минут.

По истечении этого времени подвергните смесь клеток и плазмиды тепловому шоку, поместив ее в водяную баню при 42˚C на 30 секунд.

Сразу после извлечения пробирки из водяной бани поместите ее на лед и добавьте 450μL среды. Поместите пробирку в шейкер-инкубатор при 37°C на 1 час при скорости более 225 rpm для восстановления клеток.

Соблюдая правила асептической техники, нанесите 20-200uL бактериальной суспензии на чашку с LB-агаром и распределите среду по поверхности с помощью бактериологического шпателя. Инкубируйте чашки в перевернутом виде в течение ночи при 37˚C, чтобы предотвратить воздействие конденсата на бактерии.

На следующий день бактерии, поглотившие плазмиду, образуют колонии.

Далее подсчитайте количество колоний для расчета эффективности трансформации, которая представляет собой количество успешно трансформированных клеток, деленное на общее количество высеянной ДНК.

Теперь можно отобрать колонии для дальнейших экспериментов.

До приведения в компетенцию бактерии, используемые при трансформации, хранятся в морозильной камере. Их необходимо разморозить на льду, высеять на агаризированный планшет без антибиотиков и оставить для инкубации в течение ночи при 37˚C.

Соблюдая правила асептики, выберите отдельную бактериальную колонию с агарозного планшета и культивируйте её в большом объеме среды (500 ml) в течение ночи при 37˚C в in-кубаторе с перемешиванием — приборе, который предотвращает седиментацию бактерий и обеспечивает равномерное распределение питательных веществ в среде.

Пока клетки растут, приготовьте 0.1 molar раствор хлорида кальция и 0.1 molar раствор хлорида кальция с 15% глицерином; простерилизуйте их в автоклаве и охладите.

Измерения абсорбции используются для определения того, находятся ли бактерии в середине логарифмической фазы роста, при которой они легче всего поглощают ДНК. Как только клетки достигнут этой фазы, поместите их на лед и держите там на протяжении всей процедуры.

Затем разделите бактериальные клетки в две большие центрифужные пробирки и центрифугируйте при 4°C. Слейте супернатант и ресуспендируйте осадок примерно в 100 ml холодного 0.1 molar хлорида кальция. После этого инкубируйте клетки на льду в течение 30 минут. Этот этап повторяют как минимум еще один раз. Циклы центрифугирования и ресуспендирования клеток часто называют промывкой клеток.

После последней промывки ресуспендируйте клетки в 50mL холодного 0.1 molar раствора хлорида кальция с 15% глицерином. Теперь эти клетки стали химически компетентными.

Распределите по 50μL бактерий в несколько микроцентрифужных пробирок и храните при -80˚C до начала процедуры теплового шока.

Существует множество применений и вариаций бактериальной трансформации.

Помимо теплового шока, электропорация является еще одним распространенным методом трансформации. Как следует из названия, электропорация подразумевает использование электрического тока для создания пор в мембране бактериальной клетки, через которые может проникнуть ДНК.

Что касается скрининга трансформированных бактерий, плазмиды часто содержат ген, кодирующий фермент бета-галактозидазу, для облегчения этого процесса. Если в агаризованные среды добавить субстрат для этого фермента, то бактерии, трансформированные плазмидами с вставкой, образуют белые колонии, в то время как бактерии без вставки образуют синие колонии. Этот метод называется сине-белым скринингом.

В большинстве экспериментов по трансформации целью является получение быстро делящихся бактерий для наработки больших количеств вашей плазмиды, содержащей целевой ген. После бактериальной трансформации следующим этапом является выращивание большого количества бактерий в жидкой среде, содержащей антибиотики, и проведение очистки плазмид, которая, как следует из названия, заключается в выделении плазмид из бактерий. Для этой цели доступно множество коммерческих наборов.

Иногда целью трансформации является получение бактериями больших количеств белка, кодируемого плазмидой. Здесь показаны бактериальные клетки, которые подвергаются гомогенизации и лизису перед проведением метода, называемого аффинной очисткой, для выделения целевого белка. После очистки большого количества белка его можно кристаллизовать, чтобы определить структуру интересующего белка.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по трансформации методом теплового шока. В этом видео мы рассмотрели: что такое трансформация методом теплового шока и как она работает, лежащий в её основе принцип, а также способы успешной трансформации бактерий. Спасибо за просмотр!