Бактериальная трансформация: метод теплового шока

Бактериальная трансформация является широко используемым методом, при котором чужеродная ДНК вводится в бактерию, которая затем может амплифицировать или клонировать ДНК. Клетки, которые обладают способностью легко поглощать эту ДНК, называются компетентными клетками. Несмотря на то, что трансформация происходит естественным образом у многих видов бактерий, ученые нашли способы искусственно индуцировать и повысить компетентность бактериальной клетки. В этом видео мы поговорим об одном из таких способов, преобразовании тепловым шоком.

Прежде чем мы поговорим о технике теплового шока, давайте сначала обсудим тип ДНК, наиболее часто используемый в бактериальной трансформации: плазмиду. Плазмида представляет собой маленькую, круглую, двухцепочечную ДНК, которая может уменьшать свой размер за счет суперспирализации, так что она может легко проходить через поры в клеточной мембране.

Плазмида содержит несколько важных областей, о которых стоит упомянуть. Коммерчески доступные плазмиды содержат сайт множественного клонирования или MCS. Эта область содержит специфические последовательности, распознаваемые эндонуклеазами рестрикции или ферментами рестрикции, которые расщепляют ДНК. Фрагменты ДНК, представляющие интерес для исследователя, могут быть вставлены в сайт множественного клонирования, когда плазмида и фрагмент ДНК разрезаются одними и теми же эндонуклеазами.

Плазмиды также содержат источник репликации, или ORI, который предоставляет клетке информацию о том, где должна начаться репликация плазмиды.

В дополнение к происхождению репликации и сайту множественного клонирования, большинство плазмид будут включать ген устойчивости к антибиотикам. Этот ген придает устойчивость к антибиотикам всем клеткам, содержащим плазмиду, позволяя этим клеткам выживать в средах, содержащих антибиотики.

Теперь, когда мы обсудили плазмиды, давайте поговорим о клетках, в которые они будут вводиться: компетентных клетках. Наиболее часто используемым типом бактерий в исследованиях молекулярной биологии и трансформации является кишечная палочка, которая также обитает в нижней части кишечника. Клетки обычно становятся компетентными благодаря воздействию среды, богатой кальцием.

Положительные заряды ионов кальция нейтрализуют отрицательные заряды как плазмиды, так и клеточной стенки бактерий, рассеивая электростатическое отталкивание и ослабляя клеточную стенку.

Подвергая клетки внезапному повышению температуры, или тепловому шоку, создается разница давлений между внешней и внутренней частями клетки, что вызывает образование пор, через которые может проникать суперспиральная плазмидная ДНК. После возвращения клеток к более нормальной температуре, клеточная стенка начнет самовосстанавливаться.

Как только клетки впитают плазмиду, они смогут расти на агаровых пластинах, пропитанных антибиотиком.

Перед началом трансформации теплового шока очистите рабочую зону и убедитесь, что все оборудование стерилизовано.

Убедитесь, что у вас достаточно подготовленных сред и агара, которые обеспечивают питание для бактерий, которые вы сделаете компетентными. Также обязательно стерилизуйте все растворы с помощью автоклавирования. Перед использованием дайте жидкой среде остыть до комнатной температуры и дайте агару остыть до 50-55°C, температуры, при которой можно добавлять антибиотик и заливать пластины. Дайте пластинам остыть до комнатной температуры для застывания.

При работе с бактериями всегда следует использовать асептическую технику для поддержания стерильности. Асептический метод обычно включает в себя использование горелки Бунзена для стерилизации инструментов и реагентов и создания конвекционного потока, который предотвращает попадание загрязняющих веществ в воздух в рабочее пространство.

Непосредственно перед реакцией теплового шока предварительно нагрейте среду до комнатной температуры и содержащие антибиотики пластины LB агара до 37°C. Также убедитесь, что ваша водяная баня настроена на температуру 42°C.

Далее разморозьте химически грамотные клетки на льду.

Добавьте 1-5 мкл 1 нг/мкл холодной плазмиды к бактериальным клеткам, аккуратно перемешайте и верните смесь клеток и плазмид на лед на 30 минут.

Когда время истечет, подвергните смесь клеток и плазмид тепловому шоку, поместив ее на водяную баню при температуре 42°C на 30 секунд.

Сразу после извлечения тюбика из водяной бани поставьте его на лед и добавьте 450μл среды. Поместите его в встряхивающий инкубатор при температуре 37°C на 1 час при скорости более 225 об/мин, чтобы клетки могли восстановиться.

Используя правильную асептическую технику, добавьте 20-200 мкл бактерий в агаровую пластину LB и распределите среду с помощью бактериального разбрасывателя. Инкубируйте планшеты в течение ночи при температуре 37°C вверх ногами, чтобы предотвратить попадание конденсата на бактерии.

На следующий день бактерии, которые поглотили плазмиду, образуют колонии.

Затем подсчитайте колонии, чтобы рассчитать эффективность трансформации, которая представляет собой количество успешных трансформантов, разделенное на общее количество ДНК, покрытой пластиной.

Теперь колонии можно отбирать для дальнейших экспериментов.

До того, как они станут компетентными, бактерии, используемые для трансформации, хранятся в морозильной камере. Их нужно разморозить на льду, разложить на агаровой тарелке – без антибиотиков, и дать им вырасти на ночь при температуре 37°С.

Используя асептический метод, выберите колонию бактерий из агаровой тарелки и вырастите ее в большую культуру объемом 500 мл в течение ночи при температуре 37°C в встряхивающем инкубаторе – инструменте, который предотвращает осаждение бактерий и даже рассеивание питательных веществ в среде.

Пока клетки растут, делают 0,1 моляра хлорида кальция и 0,1 моляра хлорида кальция плюс 15% растворы глицерина, автоклавируют и дают остыть.

Измерения абсорбции используются для определения того, находятся ли бактерии в средней логарифмической фазе роста, что означает, что они легко поглощают ДНК. Как только клетки достигнут этой фазы, поместите их на лед и держите там на протяжении всей процедуры.

Затем разделите бактериальные клетки на две большие центрифужные пробирки и вращайте при температуре 4°C. Слейте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте примерно в 100 мл 0,1 моляра холодного хлорида кальция. Затем инкубируйте клетки на льду в течение 30 минут. Этот шаг повторяется как минимум еще один раз. Циклы вращения и ресуспензии клеток часто называют промыванием клеток.

После окончательной промывки ресуспендируйте клетки в холодном 50мл 0,1 моляра хлорида кальция плюс 15% раствор глицерина. Эти клетки теперь химически компетентны.

Распределите 50 мкл бактерий по нескольким микрофуговым пробиркам и храните при температуре -80°C до готовности к тепловому шоку.

Существует множество применений и вариаций бактериальной трансформации.

В дополнение к тепловому шоку, еще одним распространенным методом трансформации является электропорация. Как следует из названия, электропорация включает в себя использование электричества для создания пор в мембране бактериальной клетки, через которые может проходить ДНК.

Что касается скрининга трансформированных бактерий, плазмиды часто содержат ген, кодирующий фермент бета-галактозидазу, что помогает в скрининге. Когда субстрат для этого фермента включен в агаровые пластины, бактерии, которые были преобразованы с плазмидами, содержащими вставку, дают белые колонии, в то время как те, которые этого не делают, дают синие колонии. Этот метод называется сине-белым отсеиванием.

В большинстве экспериментов по трансформации цель состоит в том, чтобы заставить быстро делящиеся бактерии производить большое количество плазмиды, которая включает в себя ваш целевой ген. После бактериальной трансформации следующим шагом является выращивание большого количества бактерий в жидкой среде, содержащей антибиотики, и проведение очистки плазмид, которая, как следует из названия, включает в себя очистку плазмид от бактерий. Для этой цели существует множество коммерческих наборов.

Иногда цель трансформации состоит в том, чтобы бактерии генерировали большое количество белка, кодируемого плазмидой. Здесь вы видите, как бактериальные клетки гомогенизируются и лизируются перед тем, как можно будет выполнить метод, называемый аффинной очисткой, для выделения целевого белка. После очистки большого количества белка он может быть кристаллизован и может быть идентифицирована структура конкретного белка, представляющего интерес.

Вы только что посмотрели JoVE Введение в преобразования теплового шока. В этом видео мы рассмотрели: что такое трансформация с помощью теплового шока и как она работает, в чем ее суть и как успешно трансформировать бактерии. Спасибо за просмотр!