ИФА, или иммуноферментный анализ, является широко используемым методом определения наличия или отсутствия определенного целевого белка.
С помощью серии этапов промывки и связывания антитело, конъюгированное или связанное с ферментом, будет распознавать целевой белок на дне 96-луночного планшета. Когда субстрат добавляется в образец, происходит ферментативная реакция, вызывающая изменение цвета, что позволяет идентифицировать и количественно оценить целевой белок.
Прежде чем мы обсудим, как провести ИФА, давайте познакомимся с оборудованием и реагентами, которые вам понадобятся.
Реакцией ИФА обычно служит 96-луночный планшет с плоским дном. Плоское дно лунок поможет обеспечить равномерное распределение экспериментального образца, а также антител для захвата и обнаружения.
ИФА обнаруживают присутствие специфических белков-мишеней в экспериментальных водных растворах. Моча, среды для клеточных культур и сыворотка являются распространенными экспериментальными образцами.
В ИФА антитело, которое непосредственно связывается с белком-мишенью, является первичным антителом. Он обладает высоким сродством, то есть высокой способностью плотно связываться с эпитопом – определенной областью – белка-мишени. Первичное антитело обычно является немеченным или неконъюгированным.
Как уже упоминалось, антитела в основном связываются со своими белками-мишенями посредством высокоаффинного связывания с определенным эпитопом. Тем не менее, экспериментальный образец может содержать фрагменты клеток, которые экспрессируют неспецифические сайты связывания, сайты, которые могут связываться с постоянной или неэпитопоспецифичной областью антител детектора.
Таким образом, добавление блокирующего буфера имеет важное значение в ИФА для охвата любых неспецифических сайтов связывания в экспериментальных образцах. В противном случае у вас могут произойти ферментативные реакции, происходящие в лунках, которые не содержат целевого белка, что даст вам ложноположительные результаты!
Вторичное антитело в ИФА — это антитело, используемое для распознавания первичного антитела. Это антитело обычно конъюгировано с ферментом. Иногда вторичное антитело имеет странное название. Например, если вторичное антитело вырабатывается или выращивается у осла для распознавания первичного антитела, выращенного у козы, вторичное антитело будет называться антителом против козы осла. Когда дело доходит до наименования вторичных антител, первое название указывает на организм, который произвел вторичное антитело, а второе название представляет организм, который производит первичное антитело.
Также потребуется субстрат, который связывается с активным центром фермента, связанного со вторичным антителом. Химическая реакция, происходящая во время этой реакции, вызывает изменение цвета бесцветного субстрата. Этот так называемый колориметрический анализ позволяет идентифицировать и количественно оценить присутствие целевого белка.
Ферментативная реакция будет продолжаться до тех пор, пока есть доступный субстрат. Поэтому после короткого инкубационного периода в лунки добавляют стоп-раствор, который вызывает еще одно изменение цвета, указывающее на то, что реакция на самом деле остановлена.
Считыватель микропланшетов будет использоваться для количественной оценки концентрации интересующего белка в каждой лунке путем считывания абсорбции, то есть количества окрашенного продукта, в каждой лунке. Абсорбция пропорциональна количеству присутствующего целевого белка.
Теперь, когда все оборудование готово, давайте запустим ИФА!
Чтобы выполнить стандартный, или прямой, ИФА, сначала покройте лунки 96-луночного планшета интересующим вас целевым белком, разведенным в буфере для покрытия. В это время также отметьте свои положительные и отрицательные контрольные точки.
После инкубации пластины с покрытием достаточно долго, чтобы дать белку время полностью адсорбироваться или прикрепиться к нижней части пластины, слейте излишки раствора покрытия быстрым движением запястья.
Затем заблокируйте любой возможный неспецифический сигнал связывания или фоновый сигнал, инкубируя каждую лунку в блокирующем буфере.
Теперь слейте блокирующий буфер и промойте лунки короткой инкубацией при комнатной температуре в фосфатно-солевом буфере или PBS и 1% BSA.
Пока лунки промываются PBS, приготовьте разведения известной концентрации целевого белка для создания стандартной кривой. Поглощение стандартных кривых лунок, которые содержат известные концентрации целевого белка, будет использоваться для расчета концентрации целевого белка в ваших экспериментальных лунках на основе сравнения поглощения пробных лунок с поглощением стандартных кривых лунок.
Теперь пришло время добавить обнаружение или первичное антитело!
Затем планшет инкубируют, обычно при комнатной температуре, чтобы позволить достаточному количеству антител связываться с белком-мишенью для последующего обнаружения и количественного определения белка.
После такой инкубации излишки антител удаляют и лунки кратковременно промывают PBS.
Затем в планшет добавляют вторичное антитело, и планшет снова инкубируют – обычно на вращающейся платформе – чтобы позволить вторичному антителу связаться. Этапы стирки повторяются, как и раньше.
Затем добавьте субстрат на пластину, чтобы увидеть, какие лунки содержат целевой белок. Накройте пластину, чтобы защитить реакцию от света, а затем после короткой инкубации остановите реакцию с помощью стоп-раствора.
Наконец, поместите планшет в считыватель микропланшетов, чтобы измерить поглощение или количество окрашенного раствора в каждой лунке. Вам нужно будет выбрать, какие скважины вы хотите, чтобы читатель проанализировал. Когда прибор закончит считывание показаний с планшета, отобразятся показания абсорбции для каждой лунки.
Важно отметить, что каждый набор ИФА имеет предел обнаружения. То есть можно точно определить только концентрации белка выше и ниже определенных пределов. Очень малые концентрации белка обычно слишком близки к фоновым уровням неспецифического окрашивания, в то время как очень высокие концентрации могут указывать на то, что избыток белка или антитела не был должным образом смыт в этом образце.
Так зачем же проводить ИФА? Давайте рассмотрим несколько распространенных приложений.
Вероятно, наиболее распространенным типом проводимого ИФА является сэндвич-ИФА.
В сэндвич-ИФА 96-луночный планшет сначала покрывается первичным антителом, которое распознает целевой белок, представляющий интерес.
В этом эксперименте среды для клеточных культур, собранные из клеточных линий, продуцирующих антитела человека, были нанесены с помощью автоматизированной системы на 96-луночные планшеты, предварительно покрытые первичным антителом, распознающим человеческие антитела.
После смывания лишнего образца с помощью PBS добавляется вторичное антитело, связанное с ферментами, за которым следует колориметрический субстрат.
Затем поглощающая способность измеряется таким же образом, как и при обычном ИФА. Например, в этом эксперименте эти данные ИФА будут использоваться для определения того, какие клеточные линии продуцируют антитело человека с наибольшим сродством к своему целевому антигену, то есть наилучшей способностью точно связываться с ним.
Безрецептурный тест на беременность представляет собой один из видов сэндвича ИФА.
Когда моча потенциально беременной женщины добавляется к тесту, связанные с ферментами первичные антитела, прикрепленные к тесту, связывают гормон беременности ХГЧ, если он присутствует. Если женщина беременна, произойдет субстратно-энизмическая реакция, когда первичные антитела будут распознаны связанными с субстратом вторичными антителами в тестовом месте, и появится цветная линия.
Еще одним типом ИФА является конкурентный ИФА, который может быть использован для выявления наличия антител.
Если интересующие антитела присутствуют в образце, они будут связываться с белком-мишенью, прикрепленным к нижней части планшета. Позже, когда в планшет добавляются антитела, связанные с ферментами, антитела, связанные с ферментами, практически не находят белков для связывания; Они будут «вытеснены» антителами, представляющими интерес в экспериментальном образце.
Таким образом, в соревновательном ИФА цветные лунки указывают на образцы, которые на самом деле не содержат интересующего антитела! Образцы плазмы крови пациента обычно обрабатываются в условиях конкурентного иммуноферментного анализа, чтобы определить, присутствуют ли в образце антитела к определенным патогенам, таким как вирус ВИЧ.
Вы только что посмотрели JoVE введение в проведение ИФА. В этом видео мы рассмотрели: что такое ИФА и как он работает; какое оборудование и реагенты вам понадобятся для выполнения и ИФА; и некоторые различные применения этого анализа. Спасибо за просмотр, и не забывайте о том, чтобы ваш субстрат не развился слишком сильно!
Иммуноферментный анализ (ИФА) обычно проводится для определения наличия и/или количества целевого белка, представляющего интерес, в экспериментальном…
ИФА, или иммуноферментный анализ, является широко используемым методом определения наличия или отсутствия определенного целевого белка.
С помощью серии этапов промывки и связывания антитело, конъюгированное или связанное с ферментом, будет распознавать целевой белок на дне 96-луночного планшета. Когда субстрат добавляется в образец, происходит ферментативная реакция, вызывающая изменение цвета, что позволяет идентифицировать и количественно оценить целевой белок.
Прежде чем мы обсудим, как провести ИФА, давайте познакомимся с оборудованием и реагентами, которые вам понадобятся.
Реакцией ИФА обычно служит 96-луночный планшет с плоским дном. Плоское дно лунок поможет обеспечить равномерное распределение экспериментального образца, а также антител для захвата и обнаружения.
ИФА обнаруживают присутствие специфических белков-мишеней в экспериментальных водных растворах. Моча, среды для клеточных культур и сыворотка являются распространенными экспериментальными образцами.
В ИФА антитело, которое непосредственно связывается с белком-мишенью, является первичным антителом. Он обладает высоким сродством, то есть высокой способностью плотно связываться с эпитопом – определенной областью – белка-мишени. Первичное антитело обычно является немеченным или неконъюгированным.
Как уже упоминалось, антитела в основном связываются со своими белками-мишенями посредством высокоаффинного связывания с определенным эпитопом. Тем не менее, экспериментальный образец может содержать фрагменты клеток, которые экспрессируют неспецифические сайты связывания, сайты, которые могут связываться с постоянной или неэпитопоспецифичной областью антител детектора.
Таким образом, добавление блокирующего буфера имеет важное значение в ИФА для охвата любых неспецифических сайтов связывания в экспериментальных образцах. В противном случае у вас могут произойти ферментативные реакции, происходящие в лунках, которые не содержат целевого белка, что даст вам ложноположительные результаты!
Вторичное антитело в ИФА — это антитело, используемое для распознавания первичного антитела. Это антитело обычно конъюгировано с ферментом. Иногда вторичное антитело имеет странное название. Например, если вторичное антитело вырабатывается или выращивается у осла для распознавания первичного антитела, выращенного у козы, вторичное антитело будет называться антителом против козы осла. Когда дело доходит до наименования вторичных антител, первое название указывает на организм, который произвел вторичное антитело, а второе название представляет организм, который производит первичное антитело.
Также потребуется субстрат, который связывается с активным центром фермента, связанного со вторичным антителом. Химическая реакция, происходящая во время этой реакции, вызывает изменение цвета бесцветного субстрата. Этот так называемый колориметрический анализ позволяет идентифицировать и количественно оценить присутствие целевого белка.
Ферментативная реакция будет продолжаться до тех пор, пока есть доступный субстрат. Поэтому после короткого инкубационного периода в лунки добавляют стоп-раствор, который вызывает еще одно изменение цвета, указывающее на то, что реакция на самом деле остановлена.
Считыватель микропланшетов будет использоваться для количественной оценки концентрации интересующего белка в каждой лунке путем считывания абсорбции, то есть количества окрашенного продукта, в каждой лунке. Абсорбция пропорциональна количеству присутствующего целевого белка.
Теперь, когда все оборудование готово, давайте запустим ИФА!
Чтобы выполнить стандартный, или прямой, ИФА, сначала покройте лунки 96-луночного планшета интересующим вас целевым белком, разведенным в буфере для покрытия. В это время также отметьте свои положительные и отрицательные контрольные точки.
После инкубации пластины с покрытием достаточно долго, чтобы дать белку время полностью адсорбироваться или прикрепиться к нижней части пластины, слейте излишки раствора покрытия быстрым движением запястья.
Затем заблокируйте любой возможный неспецифический сигнал связывания или фоновый сигнал, инкубируя каждую лунку в блокирующем буфере.
Теперь слейте блокирующий буфер и промойте лунки короткой инкубацией при комнатной температуре в фосфатно-солевом буфере или PBS и 1% BSA.
Пока лунки промываются PBS, приготовьте разведения известной концентрации целевого белка для создания стандартной кривой. Поглощение стандартных кривых лунок, которые содержат известные концентрации целевого белка, будет использоваться для расчета концентрации целевого белка в ваших экспериментальных лунках на основе сравнения поглощения пробных лунок с поглощением стандартных кривых лунок.
Теперь пришло время добавить обнаружение или первичное антитело!
Затем планшет инкубируют, обычно при комнатной температуре, чтобы позволить достаточному количеству антител связываться с белком-мишенью для последующего обнаружения и количественного определения белка.
После такой инкубации излишки антител удаляют и лунки кратковременно промывают PBS.
Затем в планшет добавляют вторичное антитело, и планшет снова инкубируют – обычно на вращающейся платформе – чтобы позволить вторичному антителу связаться. Этапы стирки повторяются, как и раньше.
Затем добавьте субстрат на пластину, чтобы увидеть, какие лунки содержат целевой белок. Накройте пластину, чтобы защитить реакцию от света, а затем после короткой инкубации остановите реакцию с помощью стоп-раствора.
Наконец, поместите планшет в считыватель микропланшетов, чтобы измерить поглощение или количество окрашенного раствора в каждой лунке. Вам нужно будет выбрать, какие скважины вы хотите, чтобы читатель проанализировал. Когда прибор закончит считывание показаний с планшета, отобразятся показания абсорбции для каждой лунки.
Важно отметить, что каждый набор ИФА имеет предел обнаружения. То есть можно точно определить только концентрации белка выше и ниже определенных пределов. Очень малые концентрации белка обычно слишком близки к фоновым уровням неспецифического окрашивания, в то время как очень высокие концентрации могут указывать на то, что избыток белка или антитела не был должным образом смыт в этом образце.
Так зачем же проводить ИФА? Давайте рассмотрим несколько распространенных приложений.
Вероятно, наиболее распространенным типом проводимого ИФА является сэндвич-ИФА.
В сэндвич-ИФА 96-луночный планшет сначала покрывается первичным антителом, которое распознает целевой белок, представляющий интерес.
В этом эксперименте среды для клеточных культур, собранные из клеточных линий, продуцирующих антитела человека, были нанесены с помощью автоматизированной системы на 96-луночные планшеты, предварительно покрытые первичным антителом, распознающим человеческие антитела.
После смывания лишнего образца с помощью PBS добавляется вторичное антитело, связанное с ферментами, за которым следует колориметрический субстрат.
Затем поглощающая способность измеряется таким же образом, как и при обычном ИФА. Например, в этом эксперименте эти данные ИФА будут использоваться для определения того, какие клеточные линии продуцируют антитело человека с наибольшим сродством к своему целевому антигену, то есть наилучшей способностью точно связываться с ним.
Безрецептурный тест на беременность представляет собой один из видов сэндвича ИФА.
Когда моча потенциально беременной женщины добавляется к тесту, связанные с ферментами первичные антитела, прикрепленные к тесту, связывают гормон беременности ХГЧ, если он присутствует. Если женщина беременна, произойдет субстратно-энизмическая реакция, когда первичные антитела будут распознаны связанными с субстратом вторичными антителами в тестовом месте, и появится цветная линия.
Еще одним типом ИФА является конкурентный ИФА, который может быть использован для выявления наличия антител.
Если интересующие антитела присутствуют в образце, они будут связываться с белком-мишенью, прикрепленным к нижней части планшета. Позже, когда в планшет добавляются антитела, связанные с ферментами, антитела, связанные с ферментами, практически не находят белков для связывания; Они будут «вытеснены» антителами, представляющими интерес в экспериментальном образце.
Таким образом, в соревновательном ИФА цветные лунки указывают на образцы, которые на самом деле не содержат интересующего антитела! Образцы плазмы крови пациента обычно обрабатываются в условиях конкурентного иммуноферментного анализа, чтобы определить, присутствуют ли в образце антитела к определенным патогенам, таким как вирус ВИЧ.
Вы только что посмотрели JoVE введение в проведение ИФА. В этом видео мы рассмотрели: что такое ИФА и как он работает; какое оборудование и реагенты вам понадобятся для выполнения и ИФА; и некоторые различные применения этого анализа. Спасибо за просмотр, и не забывайте о том, чтобы ваш субстрат не развился слишком сильно!
ИФА, или иммуноферментный анализ, является широко используемым методом определения наличия или отсутствия определенного целевого белка.
С помощью серии этапов промывки и связывания антитело, конъюгированное или связанное с ферментом, будет распознавать целевой белок на дне 96-луночного планшета. Когда субстрат добавляется в образец, происходит ферментативная реакция, вызывающая изменение цвета, что позволяет идентифицировать и количественно оценить целевой белок.
Прежде чем мы обсудим, как провести ИФА, давайте познакомимся с оборудованием и реагентами, которые вам понадобятся.
Реакцией ИФА обычно служит 96-луночный планшет с плоским дном. Плоское дно лунок поможет обеспечить равномерное распределение экспериментального образца, а также антител для захвата и обнаружения.
ИФА обнаруживают присутствие специфических белков-мишеней в экспериментальных водных растворах. Моча, среды для клеточных культур и сыворотка являются распространенными экспериментальными образцами.
В ИФА антитело, которое непосредственно связывается с белком-мишенью, является первичным антителом. Он обладает высоким сродством, то есть высокой способностью плотно связываться с эпитопом – определенной областью – белка-мишени. Первичное антитело обычно является немеченным или неконъюгированным.
Как уже упоминалось, антитела в основном связываются со своими белками-мишенями посредством высокоаффинного связывания с определенным эпитопом. Тем не менее, экспериментальный образец может содержать фрагменты клеток, которые экспрессируют неспецифические сайты связывания, сайты, которые могут связываться с постоянной или неэпитопоспецифичной областью антител детектора.
Таким образом, добавление блокирующего буфера имеет важное значение в ИФА для охвата любых неспецифических сайтов связывания в экспериментальных образцах. В противном случае у вас могут произойти ферментативные реакции, происходящие в лунках, которые не содержат целевого белка, что даст вам ложноположительные результаты!
Вторичное антитело в ИФА — это антитело, используемое для распознавания первичного антитела. Это антитело обычно конъюгировано с ферментом. Иногда вторичное антитело имеет странное название. Например, если вторичное антитело вырабатывается или выращивается у осла для распознавания первичного антитела, выращенного у козы, вторичное антитело будет называться антителом против козы осла. Когда дело доходит до наименования вторичных антител, первое название указывает на организм, который произвел вторичное антитело, а второе название представляет организм, который производит первичное антитело.
Также потребуется субстрат, который связывается с активным центром фермента, связанного со вторичным антителом. Химическая реакция, происходящая во время этой реакции, вызывает изменение цвета бесцветного субстрата. Этот так называемый колориметрический анализ позволяет идентифицировать и количественно оценить присутствие целевого белка.
Ферментативная реакция будет продолжаться до тех пор, пока есть доступный субстрат. Поэтому после короткого инкубационного периода в лунки добавляют стоп-раствор, который вызывает еще одно изменение цвета, указывающее на то, что реакция на самом деле остановлена.
Считыватель микропланшетов будет использоваться для количественной оценки концентрации интересующего белка в каждой лунке путем считывания абсорбции, то есть количества окрашенного продукта, в каждой лунке. Абсорбция пропорциональна количеству присутствующего целевого белка.
Теперь, когда все оборудование готово, давайте запустим ИФА!
Чтобы выполнить стандартный, или прямой, ИФА, сначала покройте лунки 96-луночного планшета интересующим вас целевым белком, разведенным в буфере для покрытия. В это время также отметьте свои положительные и отрицательные контрольные точки.
После инкубации пластины с покрытием достаточно долго, чтобы дать белку время полностью адсорбироваться или прикрепиться к нижней части пластины, слейте излишки раствора покрытия быстрым движением запястья.
Затем заблокируйте любой возможный неспецифический сигнал связывания или фоновый сигнал, инкубируя каждую лунку в блокирующем буфере.
Теперь слейте блокирующий буфер и промойте лунки короткой инкубацией при комнатной температуре в фосфатно-солевом буфере или PBS и 1% BSA.
Пока лунки промываются PBS, приготовьте разведения известной концентрации целевого белка для создания стандартной кривой. Поглощение стандартных кривых лунок, которые содержат известные концентрации целевого белка, будет использоваться для расчета концентрации целевого белка в ваших экспериментальных лунках на основе сравнения поглощения пробных лунок с поглощением стандартных кривых лунок.
Теперь пришло время добавить обнаружение или первичное антитело!
Затем планшет инкубируют, обычно при комнатной температуре, чтобы позволить достаточному количеству антител связываться с белком-мишенью для последующего обнаружения и количественного определения белка.
После такой инкубации излишки антител удаляют и лунки кратковременно промывают PBS.
Затем в планшет добавляют вторичное антитело, и планшет снова инкубируют – обычно на вращающейся платформе – чтобы позволить вторичному антителу связаться. Этапы стирки повторяются, как и раньше.
Затем добавьте субстрат на пластину, чтобы увидеть, какие лунки содержат целевой белок. Накройте пластину, чтобы защитить реакцию от света, а затем после короткой инкубации остановите реакцию с помощью стоп-раствора.
Наконец, поместите планшет в считыватель микропланшетов, чтобы измерить поглощение или количество окрашенного раствора в каждой лунке. Вам нужно будет выбрать, какие скважины вы хотите, чтобы читатель проанализировал. Когда прибор закончит считывание показаний с планшета, отобразятся показания абсорбции для каждой лунки.
Важно отметить, что каждый набор ИФА имеет предел обнаружения. То есть можно точно определить только концентрации белка выше и ниже определенных пределов. Очень малые концентрации белка обычно слишком близки к фоновым уровням неспецифического окрашивания, в то время как очень высокие концентрации могут указывать на то, что избыток белка или антитела не был должным образом смыт в этом образце.
Так зачем же проводить ИФА? Давайте рассмотрим несколько распространенных приложений.
Вероятно, наиболее распространенным типом проводимого ИФА является сэндвич-ИФА.
В сэндвич-ИФА 96-луночный планшет сначала покрывается первичным антителом, которое распознает целевой белок, представляющий интерес.
В этом эксперименте среды для клеточных культур, собранные из клеточных линий, продуцирующих антитела человека, были нанесены с помощью автоматизированной системы на 96-луночные планшеты, предварительно покрытые первичным антителом, распознающим человеческие антитела.
После смывания лишнего образца с помощью PBS добавляется вторичное антитело, связанное с ферментами, за которым следует колориметрический субстрат.
Затем поглощающая способность измеряется таким же образом, как и при обычном ИФА. Например, в этом эксперименте эти данные ИФА будут использоваться для определения того, какие клеточные линии продуцируют антитело человека с наибольшим сродством к своему целевому антигену, то есть наилучшей способностью точно связываться с ним.
Безрецептурный тест на беременность представляет собой один из видов сэндвича ИФА.
Когда моча потенциально беременной женщины добавляется к тесту, связанные с ферментами первичные антитела, прикрепленные к тесту, связывают гормон беременности ХГЧ, если он присутствует. Если женщина беременна, произойдет субстратно-энизмическая реакция, когда первичные антитела будут распознаны связанными с субстратом вторичными антителами в тестовом месте, и появится цветная линия.
Еще одним типом ИФА является конкурентный ИФА, который может быть использован для выявления наличия антител.
Если интересующие антитела присутствуют в образце, они будут связываться с белком-мишенью, прикрепленным к нижней части планшета. Позже, когда в планшет добавляются антитела, связанные с ферментами, антитела, связанные с ферментами, практически не находят белков для связывания; Они будут «вытеснены» антителами, представляющими интерес в экспериментальном образце.
Таким образом, в соревновательном ИФА цветные лунки указывают на образцы, которые на самом деле не содержат интересующего антитела! Образцы плазмы крови пациента обычно обрабатываются в условиях конкурентного иммуноферментного анализа, чтобы определить, присутствуют ли в образце антитела к определенным патогенам, таким как вирус ВИЧ.
Вы только что посмотрели JoVE введение в проведение ИФА. В этом видео мы рассмотрели: что такое ИФА и как он работает; какое оборудование и реагенты вам понадобятся для выполнения и ИФА; и некоторые различные применения этого анализа. Спасибо за просмотр, и не забывайте о том, чтобы ваш субстрат не развился слишком сильно!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is an ELISA and how does it detect target proteins?
An ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, detects specific target proteins in experimental samples through antibody binding. Antibodies conjugated to enzymes recognize target proteins coating the bottom of a 96-well plate. When substrate is added, an enzymatic reaction occurs, causing a color change that allows identification and quantification of the target protein.
Q2: Why is a blocking buffer essential in ELISA procedures?
A blocking buffer covers nonspecific binding sites in experimental samples that could otherwise bind detector antibodies. Without blocking, enzymatic reactions may occur in wells lacking target protein, producing false positive results. This step prevents background signal and ensures accurate detection of only the target protein of interest.
Q3: How do primary and secondary antibodies work together in an ELISA?
The primary antibody directly binds to the target protein with high affinity for a specific epitope region. The secondary antibody, typically raised in a different organism, recognizes and binds to the primary antibody. The secondary antibody is enzyme-conjugated, enabling the colorimetric reaction when substrate is added.
Q4: What role does the microplate reader play in ELISA analysis?
The microplate reader quantifies protein concentration by measuring absorbance, or the amount of colored product, in each well. The absorbance is proportional to the target protein present. By comparing sample well absorbance to a standard curve of known protein concentrations, the reader determines the protein concentration in experimental samples.
Q5: What is a sandwich ELISA and how does it differ from a standard ELISA?
In a sandwich ELISA, the 96-well plate is coated first with a primary antibody that recognizes the target protein, rather than coating with the target protein itself. The target protein binds between the plate-bound primary antibody and an enzyme-linked secondary antibody, creating a sandwich structure. This format is commonly used in pregnancy tests and cell line screening applications.
Q6: How does a competitive ELISA detect antibodies in patient samples?
In a competitive ELISA, antibodies of interest in the sample bind to target protein attached to the plate bottom. When enzyme-linked detection antibodies are added, they find few binding sites because the sample antibodies have already bound the target protein. Colored wells indicate samples without the antibody of interest, making this format useful for detecting pathogen antibodies like HIV.
Q7: What determines the detection limits of an ELISA assay?
Each ELISA kit has specific detection limits based on protein concentration ranges. Very low protein concentrations are too close to background levels of nonspecific staining and cannot be accurately detected. Very high concentrations may indicate excess protein or antibody was not properly washed away, affecting result accuracy.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:43
ELISA: Components and Principles
4:03
Running an ELISA
7:18
Applications
9:53
Summary
Videos from this collection: