Очистка с помощью гель-электрофореза

Очистка фрагментов ДНК из геля представляет собой стандартную процедуру, выполняемую для выделения нужных фрагментов ДНК из агарозных гелей после электрофоретического разделения. После растворения фрагмента геля и пропускания его через специализированный фильтр в результате данной процедуры получается ДНК, очищенная от таких примесей, как соли, свободные нуклеотиды и ферменты, что делает ее пригодной для последующего использования в дальнейших исследованиях.

Основной принцип выделения ДНК из агарозного геля основан на последовательности этапов связывания, промывки и элюции. После того как гель помещают в сольватирующий буфер, его наносят на «спин-колонку», которая при центрифугировании позволяет молекулам ДНК селективно связываться с силикатным фильтром, в то время как примеси проходят сквозь него в пробирку для сбора.

Связывание ДНК с силикагелем становится возможным благодаря высокой концентрации солей в буфере для сольватизации геля. Считается, что этот буфер разрушает гидратационную структуру вокруг фильтра и создает катионный солевой мостик между сильными отрицательными зарядами на фильтре и отрицательными зарядами ДНК. Остаточные примеси удаляются путем промывки этанолом.

В колонку добавляют воду или буфер с низкой концентрацией солей, что приводит к «элюции», или высвобождению ДНК, предположительно за счет разрушения катионного мостика. Таким образом, ДНК очищается от компонентов геля.

Первым этапом процедуры очистки из геля является приготовление агарозного геля и проведение электрофореза образцов ДНК. После завершения электрофореза искомые фрагменты ДНК визуализируют в УФ-свете и отбирают путем сравнения с маркером молекулярной массы.

Если гель не окрашен, примерное положение полосы можно определить путем сравнения с лестницей ДНК. При вырезании фрагмента из геля лезвием бритвы необходимо стремиться извлечь как можно больше ДНК при минимальном количестве агарозы.

При работе с гелями, окрашенными бромистым этидием, и при воздействии УФ-излучения следует использовать перчатки и защитные очки. После вырезания нужной ДНК из геля гель и рабочий буфер следует утилизировать надлежащим образом, в соответствии с протоколами безопасности учреждения.

После выделения фрагмент геля помещают в микроцентрифужную пробирку и взвешивают на весах. Исходя из приближенного расчета, согласно которому 100 mg геля занимают 100 µL, к фрагменту геля добавляют объем буфера для солюбилизации, в 4 раза превышающий вес геля. После помещения в буфер фрагмент геля инкубируют при температуре около 50 °C для плавления агарозы.

После расплавления солюбилизированный гель переносят в спин-колонку и центрифугируют раствор, в результате чего вся ДНК и другие твердые частицы прилипают к фильтру.

Затем связанную ДНК промывают, добавляя на фильтр 70% этанол с последующим центрифугированием, что удаляет из фильтра остаточные примеси. Проскок сливают, и этот этап промывки обычно повторяют до трех раз. Пустой фильтр снова центрифугируют для удаления остатков этанола, после чего силикатный фильтр оставляют высыхать при комнатной температуре. На фильтр добавляют воду или элюирующий буфер, и после еще одного цикла центрифугирования очищенная ДНК собирается на дне пробирки.

Описанный метод применим для очистки из геля с использованием силикатных спин-колонок. Существуют и другие методы, основанные на тех же базовых принципах связывания ДНК с силикагелем с последующими этапами промывки и элюции. Например, силикагель можно смешать с ДНК в суспензии, называемой «glassmilk», которую затем можно осадить, промыть и впоследствии элюировать. Также для пропускания ДНК через силикатные фильтры и ее последующей элюции можно использовать вакуумную аспирацию. Обязательно ознакомьтесь с процедурами очистки из геля, принятыми в вашей лаборатории.

Теперь, когда вы изучили способ выделения ДНК из агарозных гелей, рассмотрим несколько последующих приложений, в которых используется ДНК, полученная путем очистки из геля.

Например, очистка из геля является промежуточным этапом в иммунопреципитации хроматина — методе, предназначенном для изоляции регуляторных белков, которые связывают геномную ДНК, с целью определения того, какие именно последовательности подвергаются регуляции. Изолированные фрагменты очищают из геля и секвенируют для их картирования на отдельные участки хромосом.

Субклонирование — процесс переноса гена из одного вектора в другой — также может включать очистку из геля. Например, последовательности генов могут быть вырезаны из одной конструкции с помощью рестриктаз и собраны в химерные последовательности посредством ПЦР, после чего они очищаются из геля и встраиваются в другие конструкции.

Возможно, самым простым применением очистки из геля является её использование после длительного хранения вырезанных полос ДНК при -80 ˚C после проведения электрофореза.

Теперь вы узнали, как экстрагировать фрагменты ДНК из агарозного геля, ознакомились с вариантами процедур связывания, промывки и элюирования, которые могут быть выбраны в зависимости от предпочтений пользователя, а также с некоторыми возможными вариантами последующего применения этого метода. Как всегда, спасибо за просмотр.