Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг — это мощный метод, используемый многими исследователями для идентификации специфических белков в электрофоретически разделенном образце с помощью антител.

Данный метод состоит из 3 основных этапов, необходимых для получения качественного результата: электроблоттинг, иммуноблоттинг и детекция. Перед началом этих этапов необходимо провести SDS-PAGE, в ходе которой денатурированные белки разделяются по размеру в полиакриламидном геле.

Электроблоттинг, также известный как вестерн-«перенос», требует использования кассеты для переноса для фиксации «сэндвича», а также аппаратуры для переноса белка из акриламидного геля на тонкую мембрану. Сэндвич для электроблоттинга состоит из геля и специализированной мембраны, зажатых между двумя листами фильтровальной бумаги. Во время переноса используется электрическое поле для перемещения белков через гель, после чего они удерживаются на мембране за счет заряженных и гидрофобных взаимодействий.

Иммуноблоттинг использует антитела для «зондирования» мембраны на наличие специфических белков. Антитела представляют собой крупные Y-образные белки, содержащие два фрагмента, также известных как Fab-области, которые связываются с другими белками. Fab-область определяет специфический эпитоп, или определенную часть белка, с которой связывается антитело.

Моноклональные антитела распознают один эпитоп и являются предпочтительным типом антител для иммуноблоттинга благодаря своей специфичности. В отличие от них, поликлональные антитела представляют собой совокупность различных антител, которые нацелены на множество эпитопов одного и того же антигена — или белка, к которому антитело обладает специфичностью. Предпочтение отдается моноклональным антителам, распознающим линейный эпитоп, так как это гарантирует, что эпитоп будет обнаружен на денатурированном, или линеаризованном, белке. Это важно, поскольку многие антитела распознают только конформационные эпитопы, что означает их способность распознавать белки только в их нативном трехмерном состоянии.

Помимо Fab-фрагментов, антитела содержат Fc-область, которая специфична для животного, продуцировавшего данное антитело. В иммуноблоттинге эта область в основном используется в качестве эпитопа для вторичного антитела — антитела, которое распознает первое антитело, связавшееся с белком, который необходимо обнаружить.

Для получения наблюдаемого сигнала антитела часто соединяют через их Fc-область с репортерным ферментом, таким как щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена. Эти репортерные ферменты создают сигнал, вступая в реакцию с субстратами, что приводит к изменению цвета или излучению света.

Эти изменения затем могут быть количественно определены с помощью денситометрии. Денситометрия — это метод, используемый для измерения плотности белковой полосы с помощью программного обеспечения для анализа изображений для расчета плотности каждой полосы. Затем полосы можно количественно оценить напрямую с использованием эталонных стандартов или с помощью внутреннего контроля с использованием контрольного образца.

Для успешного вестерн-переноса гель сначала уравновешивают в переносочном буфере в течение 15 минут. Мембрану также следует уравновесить в соответствии с инструкциями производителя.

Затем в переносочном буфере аккуратно подготавливают «сэндвич» для переноса геля, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха внутрь системы. Пузырьки, оказавшиеся в «сэндвиче», можно удалить, прокатывая по ним кончик маленького пипетора. Даже небольшие пузырьки могут нарушить перенос белков, что приведет к неполному переносу, как видно на нижних частях данной мембраны.

После сборки в камеру для переноса доливают переносочный буфер, и процесс проводят при силе тока 20-30 mA в течение 2-3 часов. Переносочный буфер содержит метанол, который усиливает связывание белков с мембраной.

По завершении переноса кассету разбирают, и качество переноса проверяют с помощью неспецифического красителя для белков, такого как Ponceau S. Это обеспечивает быстрое и обратимое обнаружение белковых полос.

Первым этапом иммуноблоттинга является заполнение свободных участков мембраны разбавленным раствором белков. Этот этап называется блокировкой и проводится для того, чтобы заблокировать мембрану и снизить неспецифическое связывание антител с ней. Как правило, блокирующий раствор состоит из бычьего сывороточного альбумина или обезжиренного сухого молока, растворенных в фосфатно-солевом буферном растворе. Обычно этот этап занимает от 1 часа до ночи при перемешивании на шейкере.

Следующим этапом является инкубация мембраны с первичными антителами, разведенными в блокирующем растворе. Этот процесс может занять от 30 минут до ночи и должен проводиться при осторожном перемешивании.

Затем мембрану тщательно промывают, чтобы снизить неспецифическое фоновое окрашивание, после чего к мембране добавляют вторичные антитела в блокирующем буфере. После короткой инкубации мембрану снова тщательно промывают.

Вторичные антитела детектируются благодаря связанным с ними репортерным ферментам. При добавлении соответствующего субстрата можно зафиксировать колориметрические или хемилюминесцентные изменения, которые затем измеряются методами денситометрии. Кроме того, маркер молекулярной массы белков служит ценным ориентиром по размеру, что позволяет оценить линейный размер каждого белка на основании того, насколько далеко он мигрировал в геле относительно маркеров размера. Определение размера белков, детектируемых методом иммуноблоттинга, позволяет убедиться, что антитело распознает нужный белок, а также определить, имеем ли мы дело с мономером или несколькими копиями белка.

Существуют тысячи коммерчески доступных первичных антител, которые позволяют обнаруживать и количественно определять специфические белки в образце. Здесь исследователь использует антитело к HIF-1α для измерения количества этого кислород-зависимого транскрипционного фактора в клеточных культурах для скрининга гипоксии. Также было использовано антитело к бета-актину в качестве контроля загрузки. Как видно, клетки, культивируемые в условиях нормального содержания кислорода, вырабатывали гораздо меньше HIF-1, чем клетки, культивируемые в условиях низкого содержания кислорода.

Комбинация 2D-электрофореза в геле и иммуноблоттинга может предоставить ценную информацию о наличии белковых комплексов. В данном случае образцы сначала разделяли по размеру белкового комплекса, а затем денатурировали, чтобы каждый отдельный белок в комплексе мог быть разделен по своему индивидуальному размеру. Антитела к трем различным белкам выявляют три уникальных комплекса, содержащих разное количество этих белков, причем каждый комплекс расположен в вертикальной линии. Крайний левый столбец содержит бета-2 и MCP-21, а также еще один белок, не отображаемый этими маркерами. Центральный столбец показывает комплекс, содержащий все 3 белка, а правый столбец содержит только бета-2 и MCP-21.

Иммуноблоттинг также может быть использован для визуализации белок-белковых взаимодействий. Это осуществляется путем первоначального переноса белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану с последующим зондированием этой мембраны дополнительными белками. Затем иммуноблоттинг используется для определения того, образовали ли добавленные белки комплексы с любыми из белков, иммобилизованных на мембране.

Вы только что посмотрели видео JoVE по иммуноблоттингу. Теперь вы должны понимать, как переносить белки на мембрану, проводить зондирование мембраны антителами и детектировать сигнал. Как всегда, спасибо за просмотр!