Введение в трансфекцию

Трансфекция — это процесс введения генетического материала, такого как ДНК и двухцепочечная РНК, в клетки млекопитающих. Введение ДНК обеспечивает экспрессию, или синтез, белков с использованием собственного аппарата клетки. В то же время введение двухцепочечной РНК используется для подавления синтеза определенного белка путем остановки трансляции. Этот мощный инструмент позволил исследователям более детально изучать функцию и экспрессию генов, функцию белков и генетические мутации.

Не существует универсального реагента или метода трансфекции, подходящего для всех типов клеток. К счастью, за последние несколько десятилетий было разработано множество методов и реагентов, облегчающих трансфекцию самых разных клеток. Эти методы можно разделить на две основные группы: химическую и физическую трансфекцию.

В данном видео мы сосредоточимся на различных системах химической доставки, поскольку в последние годы они стали использоваться все чаще. Эти методы включают, помимо прочего, липидные подходы, трансфекцию с помощью фосфата кальция и использование катионных полимеров.

Основной принцип всех методов химической трансфекции схож. Во всех них используются положительно заряженные молекулы-носители, которые образуют комплексы с нуклеиновыми кислотами для их последующей доставки в клетку. Эти молекулы-носители преодолевают отрицательный заряд барьера клеточной мембраны, что позволяет им проходить сквозь мембрану и доставлять свое содержимое.

При липидной трансфекции катионные липиды образуют липосому, которая затем объединяется с нуклеиновыми кислотами, формируя «трансфекционный комплекс». В то время как фосфат кальция просто конденсирует ДНК, придавая ей чистый положительный заряд. Кроме того, катионные полимеры, такие как полиэтиленимин, конденсируют ДНК в положительно заряженные частицы.

Следующим этапом химически опосредованной трансфекции является прикрепление положительно заряженных комплексов к отрицательно заряженной клеточной мембране за счет простого электростатического притяжения.

Затем комплекс проникает в клетку посредством эндоцитоза — процесса, при котором молекулы попадают в клетку через ограниченные мембраной везикулы, называемые эндосомами.

Оказавшись внутри клетки, нуклеиновые кислоты должны выйти из эндосомы с помощью механизма, который до сих пор остается неизвестным. Выйдя из эндосомы, нуклеиновые кислоты попадают в цитоплазму клетки, а затем в конечном итоге в ядро, где клеточный аппарат может синтезировать из них мРНК, а затем белок. Цитоплазма является местом действия малых интерферирующих РНК, или siRNA, которые снижают выработку белка, воздействуя на часть белково-синтезирующего аппарата клетки.

Трансфецированная ДНК может существовать либо стабильно, либо транзиторно. Стабильная трансфекция происходит, когда трансфецированная ДНК встраивается в геном и, следовательно, сохраняется при делении клеток. Транзиторная трансфекция происходит в тех случаях, когда ДНК не встраивается в геном, и экспрессия кодируемого белка утрачивается в течение примерно 24-96 часов.

Эффективность трансфекции ДНК обычно измеряют с помощью репортерных систем, связанных с вставленным геном. Это системы, которые легко обнаружить либо путем прямого наблюдения за самим репортерным белком, как в случае с зеленым флуоресцентным белком, либо путем измерения его ферментативной активности с использованием колориметрического анализа, как в случае с репортерным ферментом люциферазой. Стабильная трансфекция ДНК лучше всего измеряется методами геномного анализа, такими как RT-PCR.

Для оценки успешности сайленсинга siRNA уровни целевого белка в каждом образце можно определить с помощью иммуноблоттинга. Успешная трансфекция siRNA должна привести к снижению экспрессии целевого белка в клетках, в то время как уровни гена домашнего хозяйства, GAPDH, остаются стабильными.

Для максимализации эффективности трансфекции клетки в момент проведения процедуры должны находиться в логарифмической фазе роста и иметь конфлюэнтность от 40 до 80%. Чтобы этого добиться, клетки из культуры следует собрать за день до этого… подсчитать… и высеять в многолуночный планшет с такой концентрацией, которая обеспечит необходимый уровень конфлюэнтности к моменту трансфекции.

Затем смешивают химические реагенты и нуклеиновые кислоты и выдерживают их для формирования комплексов нуклеиновых кислот с реагентами. Для каждой системы химической доставки необходимо оптимизировать специфические концентрации каждого компонента.

Затем комплексы нуклеиновых кислот с реагентами добавляют к высеянным клеткам и инкубируют, часто в течение ночи, чтобы обеспечить достаточное время для прикрепления комплексов к клеткам и осуществления трансфекции. Через 24 часа среду следует удалить и заменить ее свежей культуральной средой.

Существует множество вариаций и способов применения трансфекции. Ко-трансфекция позволяет исследователю изучать влияние миссенс-мутаций на функцию клеточных белков. В данном случае в клетки HeLa была трансфецирована РНК-интерференция (RNAi) для подавления экспрессии эндогенного белка BRCA1, что приводит к снижению количества GFP-положительных клеток. Одновременно с этим в клетку трансфецировался и синтезировался мутантный белок BRCA1. Если мутантный белок сохранял полную функциональность, это приводило к восстановлению числа GFP-положительных клеток, но если мутация отрицательно влияла на функцию, то число GFP-положительных клеток оставалось низким.

В качестве альтернативы химическим методам трансфекции исследователь, показанный здесь, использует генную пушку для обстрела культур клеток золотыми частицами, покрытыми ДНК. Клетки, в цитоплазму которых попадают эти крошечные частицы-«пули» с ДНК, имеют высокую вероятность успешной трансфекции.

Еще одним альтернативным методом трансфекции является электропорация. Электропорация представляет собой воздействие электрическим током для создания временных повреждений клеточной мембраны, что позволяет ДНК или РНК проникать в клетку до того, как мембрана восстановится. Здесь электроды-пинцеты размещаются вокруг мозга мыши, и через ткань мозга пропускаются короткие электрические импульсы для инициации трансфекции ex-vivo введенных молекул RNAi, находящихся в синем растворе. Затем наблюдается влияние сайленсинга генов на структуру развивающейся коры.

Вы только что посмотрели видео JoVE, посвященное трансфекции. Как всегда, спасибо за просмотр!