Введение в трансфекцию
Трансфекция представляет собой процесс введения генетического материала, такого как DNA и двухцепочечная RNA, в клетки млекопитающих. Введение DNA в к…
Трансфекция — это процесс введения генетического материала, такого как ДНК и двухцепочечная РНК, в клетки млекопитающих. Введение ДНК обеспечивает экспрессию, или синтез, белков с использованием собственного аппарата клетки. В то же время введение двухцепочечной РНК используется для подавления синтеза определенного белка путем остановки трансляции. Этот мощный инструмент позволил исследователям более детально изучать функцию и экспрессию генов, функцию белков и генетические мутации.
Не существует универсального реагента или метода трансфекции, подходящего для всех типов клеток. К счастью, за последние несколько десятилетий было разработано множество методов и реагентов, облегчающих трансфекцию самых разных клеток. Эти методы можно разделить на две основные группы: химическую и физическую трансфекцию.
В данном видео мы сосредоточимся на различных системах химической доставки, поскольку в последние годы они стали использоваться все чаще. Эти методы включают, помимо прочего, липидные подходы, трансфекцию с помощью фосфата кальция и использование катионных полимеров.
Основной принцип всех методов химической трансфекции схож. Во всех них используются положительно заряженные молекулы-носители, которые образуют комплексы с нуклеиновыми кислотами для их последующей доставки в клетку. Эти молекулы-носители преодолевают отрицательный заряд барьера клеточной мембраны, что позволяет им проходить сквозь мембрану и доставлять свое содержимое.
При липидной трансфекции катионные липиды образуют липосому, которая затем объединяется с нуклеиновыми кислотами, формируя «трансфекционный комплекс». В то время как фосфат кальция просто конденсирует ДНК, придавая ей чистый положительный заряд. Кроме того, катионные полимеры, такие как полиэтиленимин, конденсируют ДНК в положительно заряженные частицы.
Следующим этапом химически опосредованной трансфекции является прикрепление положительно заряженных комплексов к отрицательно заряженной клеточной мембране за счет простого электростатического притяжения.
Затем комплекс проникает в клетку посредством эндоцитоза — процесса, при котором молекулы попадают в клетку через ограниченные мембраной везикулы, называемые эндосомами.
Оказавшись внутри клетки, нуклеиновые кислоты должны выйти из эндосомы с помощью механизма, который до сих пор остается неизвестным. Выйдя из эндосомы, нуклеиновые кислоты попадают в цитоплазму клетки, а затем в конечном итоге в ядро, где клеточный аппарат может синтезировать из них мРНК, а затем белок. Цитоплазма является местом действия малых интерферирующих РНК, или siRNA, которые снижают выработку белка, воздействуя на часть белково-синтезирующего аппарата клетки.
Трансфецированная ДНК может существовать либо стабильно, либо транзиторно. Стабильная трансфекция происходит, когда трансфецированная ДНК встраивается в геном и, следовательно, сохраняется при делении клеток. Транзиторная трансфекция происходит в тех случаях, когда ДНК не встраивается в геном, и экспрессия кодируемого белка утрачивается в течение примерно 24-96 часов.
Эффективность трансфекции ДНК обычно измеряют с помощью репортерных систем, связанных с вставленным геном. Это системы, которые легко обнаружить либо путем прямого наблюдения за самим репортерным белком, как в случае с зеленым флуоресцентным белком, либо путем измерения его ферментативной активности с использованием колориметрического анализа, как в случае с репортерным ферментом люциферазой. Стабильная трансфекция ДНК лучше всего измеряется методами геномного анализа, такими как RT-PCR.
Для оценки успешности сайленсинга siRNA уровни целевого белка в каждом образце можно определить с помощью иммуноблоттинга. Успешная трансфекция siRNA должна привести к снижению экспрессии целевого белка в клетках, в то время как уровни гена домашнего хозяйства, GAPDH, остаются стабильными.
Для максимализации эффективности трансфекции клетки в момент проведения процедуры должны находиться в логарифмической фазе роста и иметь конфлюэнтность от 40 до 80%. Чтобы этого добиться, клетки из культуры следует собрать за день до этого… подсчитать… и высеять в многолуночный планшет с такой концентрацией, которая обеспечит необходимый уровень конфлюэнтности к моменту трансфекции.
Затем смешивают химические реагенты и нуклеиновые кислоты и выдерживают их для формирования комплексов нуклеиновых кислот с реагентами. Для каждой системы химической доставки необходимо оптимизировать специфические концентрации каждого компонента.
Затем комплексы нуклеиновых кислот с реагентами добавляют к высеянным клеткам и инкубируют, часто в течение ночи, чтобы обеспечить достаточное время для прикрепления комплексов к клеткам и осуществления трансфекции. Через 24 часа среду следует удалить и заменить ее свежей культуральной средой.
Существует множество вариаций и способов применения трансфекции. Ко-трансфекция позволяет исследователю изучать влияние миссенс-мутаций на функцию клеточных белков. В данном случае в клетки HeLa была трансфецирована РНК-интерференция (RNAi) для подавления экспрессии эндогенного белка BRCA1, что приводит к снижению количества GFP-положительных клеток. Одновременно с этим в клетку трансфецировался и синтезировался мутантный белок BRCA1. Если мутантный белок сохранял полную функциональность, это приводило к восстановлению числа GFP-положительных клеток, но если мутация отрицательно влияла на функцию, то число GFP-положительных клеток оставалось низким.
В качестве альтернативы химическим методам трансфекции исследователь, показанный здесь, использует генную пушку для обстрела культур клеток золотыми частицами, покрытыми ДНК. Клетки, в цитоплазму которых попадают эти крошечные частицы-«пули» с ДНК, имеют высокую вероятность успешной трансфекции.
Еще одним альтернативным методом трансфекции является электропорация. Электропорация представляет собой воздействие электрическим током для создания временных повреждений клеточной мембраны, что позволяет ДНК или РНК проникать в клетку до того, как мембрана восстановится. Здесь электроды-пинцеты размещаются вокруг мозга мыши, и через ткань мозга пропускаются короткие электрические импульсы для инициации трансфекции ex-vivo введенных молекул RNAi, находящихся в синем растворе. Затем наблюдается влияние сайленсинга генов на структуру развивающейся коры.
Вы только что посмотрели видео JoVE, посвященное трансфекции. Как всегда, спасибо за просмотр!
Трансфекция — это процесс введения генетического материала, такого как ДНК и двухцепочечная РНК, в клетки млекопитающих. Введение ДНК обеспечивает экспрессию, или синтез, белков с использованием собственного аппарата клетки. В то же время введение двухцепочечной РНК используется для подавления синтеза определенного белка путем остановки трансляции. Этот мощный инструмент позволил исследователям более детально изучать функцию и экспрессию генов, функцию белков и генетические мутации.
Не существует универсального реагента или метода трансфекции, подходящего для всех типов клеток. К счастью, за последние несколько десятилетий было разработано множество методов и реагентов, облегчающих трансфекцию самых разных клеток. Эти методы можно разделить на две основные группы: химическую и физическую трансфекцию.
В данном видео мы сосредоточимся на различных системах химической доставки, поскольку в последние годы они стали использоваться все чаще. Эти методы включают, помимо прочего, липидные подходы, трансфекцию с помощью фосфата кальция и использование катионных полимеров.
Основной принцип всех методов химической трансфекции схож. Во всех них используются положительно заряженные молекулы-носители, которые образуют комплексы с нуклеиновыми кислотами для их последующей доставки в клетку. Эти молекулы-носители преодолевают отрицательный заряд барьера клеточной мембраны, что позволяет им проходить сквозь мембрану и доставлять свое содержимое.
При липидной трансфекции катионные липиды образуют липосому, которая затем объединяется с нуклеиновыми кислотами, формируя «трансфекционный комплекс». В то время как фосфат кальция просто конденсирует ДНК, придавая ей чистый положительный заряд. Кроме того, катионные полимеры, такие как полиэтиленимин, конденсируют ДНК в положительно заряженные частицы.
Следующим этапом химически опосредованной трансфекции является прикрепление положительно заряженных комплексов к отрицательно заряженной клеточной мембране за счет простого электростатического притяжения.
Затем комплекс проникает в клетку посредством эндоцитоза — процесса, при котором молекулы попадают в клетку через ограниченные мембраной везикулы, называемые эндосомами.
Оказавшись внутри клетки, нуклеиновые кислоты должны выйти из эндосомы с помощью механизма, который до сих пор остается неизвестным. Выйдя из эндосомы, нуклеиновые кислоты попадают в цитоплазму клетки, а затем в конечном итоге в ядро, где клеточный аппарат может синтезировать из них мРНК, а затем белок. Цитоплазма является местом действия малых интерферирующих РНК, или siRNA, которые снижают выработку белка, воздействуя на часть белково-синтезирующего аппарата клетки.
Трансфецированная ДНК может существовать либо стабильно, либо транзиторно. Стабильная трансфекция происходит, когда трансфецированная ДНК встраивается в геном и, следовательно, сохраняется при делении клеток. Транзиторная трансфекция происходит в тех случаях, когда ДНК не встраивается в геном, и экспрессия кодируемого белка утрачивается в течение примерно 24-96 часов.
Эффективность трансфекции ДНК обычно измеряют с помощью репортерных систем, связанных с вставленным геном. Это системы, которые легко обнаружить либо путем прямого наблюдения за самим репортерным белком, как в случае с зеленым флуоресцентным белком, либо путем измерения его ферментативной активности с использованием колориметрического анализа, как в случае с репортерным ферментом люциферазой. Стабильная трансфекция ДНК лучше всего измеряется методами геномного анализа, такими как RT-PCR.
Для оценки успешности сайленсинга siRNA уровни целевого белка в каждом образце можно определить с помощью иммуноблоттинга. Успешная трансфекция siRNA должна привести к снижению экспрессии целевого белка в клетках, в то время как уровни гена домашнего хозяйства, GAPDH, остаются стабильными.
Для максимализации эффективности трансфекции клетки в момент проведения процедуры должны находиться в логарифмической фазе роста и иметь конфлюэнтность от 40 до 80%. Чтобы этого добиться, клетки из культуры следует собрать за день до этого… подсчитать… и высеять в многолуночный планшет с такой концентрацией, которая обеспечит необходимый уровень конфлюэнтности к моменту трансфекции.
Затем смешивают химические реагенты и нуклеиновые кислоты и выдерживают их для формирования комплексов нуклеиновых кислот с реагентами. Для каждой системы химической доставки необходимо оптимизировать специфические концентрации каждого компонента.
Затем комплексы нуклеиновых кислот с реагентами добавляют к высеянным клеткам и инкубируют, часто в течение ночи, чтобы обеспечить достаточное время для прикрепления комплексов к клеткам и осуществления трансфекции. Через 24 часа среду следует удалить и заменить ее свежей культуральной средой.
Существует множество вариаций и способов применения трансфекции. Ко-трансфекция позволяет исследователю изучать влияние миссенс-мутаций на функцию клеточных белков. В данном случае в клетки HeLa была трансфецирована РНК-интерференция (RNAi) для подавления экспрессии эндогенного белка BRCA1, что приводит к снижению количества GFP-положительных клеток. Одновременно с этим в клетку трансфецировался и синтезировался мутантный белок BRCA1. Если мутантный белок сохранял полную функциональность, это приводило к восстановлению числа GFP-положительных клеток, но если мутация отрицательно влияла на функцию, то число GFP-положительных клеток оставалось низким.
В качестве альтернативы химическим методам трансфекции исследователь, показанный здесь, использует генную пушку для обстрела культур клеток золотыми частицами, покрытыми ДНК. Клетки, в цитоплазму которых попадают эти крошечные частицы-«пули» с ДНК, имеют высокую вероятность успешной трансфекции.
Еще одним альтернативным методом трансфекции является электропорация. Электропорация представляет собой воздействие электрическим током для создания временных повреждений клеточной мембраны, что позволяет ДНК или РНК проникать в клетку до того, как мембрана восстановится. Здесь электроды-пинцеты размещаются вокруг мозга мыши, и через ткань мозга пропускаются короткие электрические импульсы для инициации трансфекции ex-vivo введенных молекул RNAi, находящихся в синем растворе. Затем наблюдается влияние сайленсинга генов на структуру развивающейся коры.
Вы только что посмотрели видео JoVE, посвященное трансфекции. Как всегда, спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between transfecting DNA and RNA into cells?
DNA transfection enables protein expression using the cell's machinery, while RNA transfection, particularly double-stranded RNA or siRNA, shuts down specific protein production by stopping translation. DNA must reach the nucleus for effective expression, whereas RNA acts in the cytoplasm. DNA can be stably incorporated into the genome or transiently expressed, while RNA effects are temporary.
Q2: How do chemical transfection methods deliver genetic material into cells?
Chemical transfection uses positively charged carrier molecules—such as cationic lipids, calcium phosphate, or polymers—that complex with negatively charged nucleic acids. These complexes attach to the negatively charged cell membrane through electrostatic attraction, then enter via endocytosis in membrane-bound vesicles called endosomes. The nucleic acids escape the endosome and reach their destination in the cytoplasm or nucleus.
Q3: What cell conditions optimize transfection efficiency?
Cells should be in log phase growth and between 40 and 80% confluent at transfection time. Prepare cells by harvesting them the day before, counting them, and seeding at appropriate concentration. After adding nucleic acid-reagent complexes, incubate overnight to allow attachment and transfection. Replace media with fresh culture after 24 hours to support cell recovery and gene expression.
Q4: How is transfection efficiency measured in cells?
Reporter systems tethered to inserted genes measure DNA transfection efficiency. Green fluorescent protein can be directly observed, while luciferase enzyme activity is measured using colorimetric assays. Stable transfection is verified by genomic analysis such as RT-PCR. For siRNA silencing success, immunoblot analysis determines target protein levels; successful transfection decreases target protein while housekeeping genes like GAPDH remain stable.
Q5: What is the difference between stable and transient transfection?
Stable transfection occurs when transfected DNA integrates into the genome and persists through cell division, creating permanent genetic changes. Transient transfection involves DNA that remains outside the genome, resulting in temporary protein expression lasting 24 to 96 hours before being lost. Stable transfection is measured by genomic analysis, while transient effects are detected through reporter systems.
Q6: What are alternative physical methods for transfecting cells?
Electroporation uses electrical current to temporarily damage the cell membrane, allowing DNA or RNA entry before cells repair. A gene gun fires gold particles coated with DNA directly into cells; particles reaching the cytoplasm enable transfection. These physical methods complement chemical approaches and are useful for cell types resistant to chemical reagents or for in vivo applications like brain tissue transfection.
Q7: How can co-transfection be used to study protein mutations?
Co-transfection simultaneously introduces interfering RNA and mutant DNA into the same cell. RNAi down-regulates the endogenous protein while the transfected mutant version is produced. Comparing functional outcomes—such as recovery of fluorescent reporter signals—reveals whether the mutation preserves or impairs protein function. This approach enables direct assessment of mutation effects on cellular processes.