Реакции лигирования ДНК

Лигирование можно определить как процесс соединения, а в биологии этот термин относится к ферментативной реакции, в результате которой две биомолекулы соединяются ковалентной связью. В данном видео описывается применение лигирования ДНК в исследованиях по молекулярной биологии.

В клетке ДНК-лигазы представляют собой ферменты, которые распознают и «запечатывают» разрывы в ДНК, катализируя образование фосфодиэфирных связей между 3’-гидроксильной и 5’-фосфатной группами остова ДНК. Лигация происходит в рамках нормальных клеточных процессов, таких как репликация ДНК, для репарации одноцепочечных и двухцепочечных разрывов ДНК.

В лабораторной практике ДНК-лигазы регулярно используются в молекулярном клонировании — процессе соединения фрагментов ДНК (вставок), расщепленных эндонуклеазами, с вектором, также расщепленным эндонуклеазой (например, плазмидой), чтобы фрагмент мог быть введен в клетки-хозяева и затем реплицирован.

Эндонуклеазное расщепление предполагает использование рестрикционных эндонуклеаз, или рестриктаз, которые создают надрезы в специфических участках ДНК.

Эти надрезы могут напоминать одноцепочечные разрывы, создающие 3’- и 5’-выступающие концы, называемые «липкими», или двухцепочечные разрывы без выступов, называемые «тупыми». Лигация липких концов более выгодна, так как комплементарные выступающие пары оснований стабилизируют реакцию. Поскольку при лигации тупых концов отсутствует комплементарное спаривание оснований, эта реакция менее эффективна, и ферменту сложнее соединить концы. В обычных условиях липкие и тупые концы не могут быть лигированы друг с другом.

Однако фрагмент Кленова — продукт ДНК-полимеразы 1, расщепленной субтилизином, — может превращать липкие концы в тупые. Фрагмент Кленова обладает 3’-5’-экзонуклеазной активностью, которая «отгрызает» 3’-выступы, и полимеразной активностью, которая делает тупыми 5’-выступы путем достраивания 3’-конца комплементарной цепи.

Когда целью является вставка гена в плазмиду, повторное соединение ДНК вектора, называемое самолигацией, является распространенным нежелательным результатом реакции лигации. Обработка ДНК вектора щелочной фосфатазой после расщепления удаляет 5’-фосфаты с обоих концов и предотвращает этот нежелательный исход.

Как упоминалось ранее, перед началом лигирования ДНК вектора и вставки подвергают расщеплению эндонуклеазами. После гель-очистки расщепленного вектора и вставки концентрации ДНК измеряют с помощью спектрофотометра, чтобы определить концентрацию очищенного вектора и вставки.

На основании этой концентрации можно определить количество молекул вставки или вектора в 1 µl, исходя из средней молекулярной массы одной пары оснований ДНК и общего количества пар оснований в каждом фрагменте. Опираясь на рассчитанную молярную концентрацию вектора и вставки, вычисляют соотношение вставки и вектора 3:1, чтобы определить объемы вектора и вставки, используемые в реакции. Соотношение ДНК вставки к вектору 3:1 является предпочтительным, так как оно повышает вероятность лигирования вставки в вектор по сравнению с самолигированием вектора.

После того как мы определили количество ДНК вектора и вставки для использования в реакции, мы переходим к подготовке реакционной смеси для лигирования на льду. Компоненты реакции следует добавлять в микроцентрифужную пробирку в следующем порядке: стерильная вода в объеме, достаточном для достижения конечного объема 10 µl (в нашем случае мы используем 4 µl), 1 µl 10X буфера для лигирования, 1 µl 10mM ATP, 1 µl вектора и 3 µl ДНК вставки (согласно расчетам) и, наконец, 1 µl ДНК-лигазы. Смесь тщательно перемешивают, центрифугируют и инкубируют при соответствующей температуре.

Температура и продолжительность реакции лигирования зависят от того, проводится ли лигирование липких или тупых концов. Например, лигирование липких концов с шестинуклеотидным одноцепочечным выступом может осуществляться при температуре, близкой к комнатной, в течение примерно 1 hr, поскольку комплементарные концы стабилизируют соединение фрагментов. Лигирование коротких выступов или тупых концов следует проводить при температуре 14-20˚C в течение ночи.

Теперь, когда мы изучили, как организовать реакцию лигирования, давайте рассмотрим некоторые области применения этой процедуры.

Лигирование может быть использовано для прямой вставки фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР, в линеаризованные плазмиды. Здесь вы видите, как исследователь берет образец замороженного мозга мыши, выделяет из него геномную ДНК, а затем подвергает ее бисульфитной ПЦР — методу на основе ПЦР для обнаружения метилированной ДНК. Затем продукты ПЦР напрямую лигируют в плазмиду для создания библиотеки генов, которые метилированы в данном конкретном отделе мозга.

Лигирование может применяться для присоединения олигонуклеотидных линкеров, содержащих сайты связывания для ПЦР-праймеров, с целью очистки фрагментов ДНК. При работе с образцами опухолей ученые могут использовать этот подход для секвенирования геномной ДНК опухоли в надежде выявить вызывающие опухоль мутации.

В этом видео лигирование проводится с ДНК, выделенной из клеток, фиксированных формальдегидом, которые впоследствии были обработаны рестриктазой и фрагментом Кленова в присутствии биотина, используемого затем для осаждения лигированной ДНК. Эта ДНК затем амплифицируется с помощью ПЦР, и продукты секвенируются для идентификации взаимодействий хроматина на различных уровнях, как показано на экране.

Теперь вы узнали о ДНК-лигазе, различных принципах организации лигации в лаборатории, потенциальных проблемах и способах их решения, а также о различных применениях лигации в исследованиях в области молекулярной биологии. Спасибо за просмотр.