2.13: Реакции лигирования ДНК

Лигирование можно определить как акт соединения, а в биологии этот термин относится к ферментативной реакции, которая соединяет две биомолекулы ковалентной связью. В этом видео описывается применение лигирования ДНК в исследованиях в области молекулярной биологии.

В клетке ДНК-лигазы являются ферментами, которые идентифицируют и запечатывают разрывы в ДНК, катализируя образование фосфодиэфирных связей между 3'-гидроксильными и 5'-фосфатными группами остова ДНК. Лигирование происходит как часть нормальных клеточных процессов, таких как репликация ДНК, для восстановления одноцепочечных и двухцепочечных разрывов ДНК.

В лабораторных условиях ДНК-лигазы обычно используются в молекулярном клонировании – процессе, который соединяет фрагменты ДНК, расщепленные эндонуклеазой, или вставки, с вектором, расщепленным эндонуклеазой, таким как плазмида, так что фрагмент может быть введен в клетки-хозяева, а затем реплицирован.

Эндонуклеазное расщепление включает в себя использование эндонуклеаз рестрикции, или ферментов рестрикции, которые создают трещины на определенных участках ДНК.

Эти зазубрины могут напоминать однопрядные разрывы, образующие 3' и 5' выступы, называемые липкими концами, или двухпрядные разрывы без выступов, называемые тупыми концами. Лигирование липких концов является преимуществом, потому что дополняющие друг друга нависающие пары оснований стабилизируют реакцию. Поскольку тупые концевые лигации не имеют комплементарного спаривания оснований, лигирование менее эффективно и ферменту сложнее соединиться с концами. Липкие и тупые концы не могут быть перевязаны друг с другом при нормальных обстоятельствах.

Тем не менее, фрагмент Кленоу, продукт ДНК-полимеразы 1, расщепленный субтилизином, может превращать липкие концы в тупые. Кленоу обладает 3'-5'-экзонуклеазной активностью, которая пережевывает 3'-выступы, и полимеразной активностью, которая притупляет 5'-выступы, удлиняя 3'-конец комплементарной цепи.

Когда целью является вставка гена в плазмиду, повторное запечатывание векторной ДНК, называемое самолигированием, является распространенным нежелательным результатом реакции лигирования. Обработка векторной ДНК щелочной фосфатазой после расщепления удаляет 5'фосфаты с обоих концов и предотвращает этот нежелательный результат.

Как мы упоминали ранее, векторные и вставные ДНК расщепляются эндонуклеазами до начала лигирования. После гель-очистки переваренного вектора и вставки, концентрации ДНК измеряют с помощью спектрофотометра для определения концентрации очищенного вектора и вставки.

Исходя из этой концентрации, количество молекул вставки или вектора в 1 мкл может быть определено на основе средней молекулярной массы пары оснований ДНК и числа пар оснований в каждом фрагменте. На основе рассчитанной молекулярной концентрации вектора и вставки рассчитывается соотношение вставки к вектору 3 к 1, чтобы определить объем вектора и вставки, используемых в реакции. Такое соотношение ДНК-инсерта к вектору 3 к 1 является желательным, потому что оно повышает вероятность того, что вставка будет лигирована в вектор по сравнению с самим векторным лигированием.

Теперь, когда мы определили количество вектора и вставной ДНК для использования в реакции, мы приступаем к настройке реакции лигирования на льду. Порядок добавления компонентов реакции в пробирку с микрофугой следующий: стерильной воды достаточно, чтобы получился конечный объем 10 мкл, в нашем случае мы будем использовать 4 мкл, 1 мкл 10X лигионного буфера, 1 мкл 10мМ АТФ, 1 мкл вектора и 3 мкл вставки ДНК, как было рассчитано, и, наконец, 1 мкл ДНК Лигазы. Реакцию тщательно перемешивают, центрифугируют и инкубируют при соответствующей температуре.

От того, проводите ли вы лигирование липким или тупым концом, зависит температура и продолжительность реакции лигирования. Например, лигирование липких концов с выступом из шести пар оснований можно проводить при комнатной температуре в течение примерно 1 часа, поскольку комплементарные концы стабилизируют соединение фрагментов. Короткие выступы или перевязки тупых концов следует проводить при температуре 14-20°C в течение ночи.

Теперь, когда мы узнали, как настроить реакцию лигирования, давайте рассмотрим некоторые из применений этой процедуры.

Лигирование может быть использовано для непосредственного введения амплифицированных с помощью ПЦР фрагментов в линеаризованные плазмиды. Здесь вы видите, как исследователь берет образец замороженного мозга мыши, выделяет из него геномную ДНК, а затем подвергает его бисульфитной ПЦР, которая является методом на основе ПЦР для обнаружения метилированной ДНК. Затем продукты ПЦР напрямую лигируются в плазмиду для создания библиотеки генов, которые метилируются в этой конкретной области мозга.

Лигирование может быть использовано для присоединения олигонуклеотидных линкеров, которые содержат сайты связывания для ПЦР-праймеров, для очистки фрагментов ДНК. При работе с образцами опухолей ученые могут использовать этот подход для секвенирования геномной ДНК опухоли с надеждой на выявление мутаций, вызывающих опухоль.

В этом видео лигирование выполняется на ДНК, выделенной из фиксированных клеток формальдегида, и затем обрабатывается ферментом рестрикции и кленоу в присутствии биотина, который затем используется для извлечения лигированной ДНК. Затем эту ДНК амплифицируют с помощью ПЦР и секвенируют продукты для идентификации взаимодействий хроматина в различных масштабах, как показано на рисунке.

Теперь вы узнали о ДНК-лигазе, различных принципах, связанных с постановкой лигирования в лаборатории, потенциальных проблемах и решениях, а также о различных применениях лигирования в исследованиях молекулярной биологии. Спасибо за просмотр.