Рестрикция рестриктазами

Рестриктазы, или рестрикционные эндонуклеазы, используются в различных целях в молекулярной биологии. Эти ферменты распознают и расщепляют специфическую последовательность ДНК, называемую сайтом рестрикции. В видеоролике, который вы сейчас увидите, представлена общая информация об этих удивительных молекулах, а также показано, как подготовить реакционную смесь для рестрикционного анализа.

Откуда вообще берутся рестриктазы? Эти ферменты представляют собой адаптацию бактерий, которая служит механизмом защиты от вирусов, известных как бактериофаги. Благодаря добавлению метильных групп в сайты рестрикции в бактериальной ДНК, рестриктазы распознают и разрезают только ДНК фага, предотвращая тем самым инфицирование.

Рестриктазы имеют довольно необычные названия. Например, HindIII, NotI, EcoRI и BamHI. Первые три буквы в названии рестриктазы указывают на организм, из которого она была выделена. Так, рестриктаза EcoRI была выделена из E. coli. Четвертая буква, если она присутствует, указывает на штамм бактерий, из которого был получен фермент. Римская цифра указывает на то, является ли данный фермент первым, вторым или третьим, выделенным из этого конкретного организма.

Рестриктазы распознают последовательность нуклеотидов, обычно длиной от четырех до восьми пар оснований, которая называется сайтом узнавания. В определенных нуклеотидах внутри этой последовательности фермент разрывает фосфодиэфирные связи в остове ДНК. Сайты узнавания обычно являются палиндромными, что означает, что последовательность читается одинаково в обоих направлениях. Когда палиндром обнаруживается на комплементарных цепях молекулы ДНК, такой палиндром называют инвертированным повтором.

Рестриктазы могут оставлять разные типы концов после расщепления ДНК: липкие концы и тупые концы. Липкие концы имеют 3’- и 5’-выступающие участки, тогда как тупые концы не имеют выступов. Тип конца определяет, каким образом фрагмент ДНК, выделенный в результате рестрикции, будет рекомбинирован с другими фрагментами ДНК в процессе, называемом лигированием.

Процедуру рестрикции должна сопровождать тщательная подготовка. Реакция расщепления обычно включает следующие компоненты: деионизированную воду, ДНК, которую необходимо разрезать, буфер, специфичный для используемого фермента, и иногда белок, называемый бычьим сывороточным альбумином или BSA. BSA стабилизирует реакцию, предотвращая прилипание фермента к стенкам контейнера, в котором проводится рестрикция. Для каждого рестрикционного фермента могут потребоваться разные условия буфера, температуры инкубации и наличие BSA. Поставщики рестрикционных ферментов предоставляют ресурсы, в которых можно найти всю необходимую информацию.

Для начала подготовки рестрикции достаньте рестрикционный фермент из морозильной камеры или холодильника. Держите рестрикционный фермент на льду или в термостойком контейнере, чтобы обеспечить оптимальную активность для последующих реакций. В пробирку для микроцентрифуги следует добавлять компоненты реакции в следующем порядке. Сначала добавьте объем стерильной воды, свободной от нуклеаз, чтобы конечный объем реакции составил 20μL. Затем добавьте 10x буфер для рестрикционных ферментов, далее BSA (при необходимости), до 1μg ДНК и 2-10 единиц фермента. Единица определяется как количество фермента, необходимое для полного расщепления 1μg контрольной ДНК за 60 минут при 37°C в объеме реакции 50μL. После этого перемешайте смесь с помощью вортекса, а затем кратковременно центрифугируйте при 12,000xg в микроцентрифуге, чтобы собрать содержимое на дне пробирки. Затем инкубируйте при оптимальной для вашего рестрикционного фермента температуре, обычно 37°C в нагревательном блоке от 1 до 4 часов.

По завершении рестрикции рекомендуется инкубировать реакционную смесь при 65˚C для тепловой инактивации рестрикционных ферментов. Хотя рестрикционные ферменты в большинстве случаев режут сайт-специфично, длительная инкубация может привести к «звездной активности» (star activity), при которой происходит расщепление в сайтах, схожих с типичными сайтами рестрикции, но отличных от них.

После инактивации следует провести электрофорез ДНК в агарозном геле, чтобы убедиться в успешности рестрикции.

Вот несколько полезных советов по проведению рестрикции и обеспечению успешного результата.

Иногда возникает ситуация, когда для получения определенного фрагмента ДНК необходимо использовать несколько ферментов. В таком случае следует проверить совместимость условий буфера и температур инкубации для двух ферментов; если они совместимы, можно провести двойное расщепление, при котором оба фермента будут работать в одной реакции. Однако иногда условия реакции для двух ферментов оказываются несовместимыми, и в этом случае решением будет последовательное использование ферментов. Например, сначала можно провести расщепление одним ферментом, а затем изменить состав буфера, чтобы он стал оптимальным для второго фермента. Другим способом преодоления несовместимости буферов при последовательном расщеплении является очистка ДНК после первого этапа рестрикции с последующим проведением второго расщепления.

Использование контролей — хороший способ понять причины неудачного расщепления. Например, контроль без фермента позволит проверить целостность образца ДНК и определить наличие экзонуклеазной активности. Использование контрольной ДНК с известными сайтами рестрикции позволяет проверить активность фермента.

Теперь, когда мы рассмотрели процесс проведения расщепления, давайте изучим различные способы применения рестриктаз.

Рестриктазы могут использоваться в диагностических целях для идентификации конкретных образцов. Загружая продукт расщепления в специальный чип, который затем помещается в прибор, называемый биоанализатором, исследователи могут анализировать размеры фрагментов ДНК, полученных в результате расщепления, чтобы определить подлинность образцов рыбы. Различные паттерны полос одного и того же гена у представителей одного вида или, в данном случае, разных видов называются полиморфизмом длин рестрикционных фрагментов.

Рестриктазы также могут применяться при субклонировании для выделения фрагмента ДНК из одной плазмиды и его вставки в другую, чтобы желаемый фрагмент мог реплицироваться с помощью бактерий.

Используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для введения сайтов рестрикции в гены в строго определенных положениях, можно применять рестриктазы для определения наличия однонуклеотидных различий в альтернативных формах одного и того же гена, или аллелях. Такие однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) трудно обнаружить с помощью только ПЦР и гель-электрофореза. При введении сайта рестрикции в область SNP простое расщепление позволяет различить аллели.

Вы только что посмотрели видео JoVE о рестрикционных эндонуклеазах. Вы узнали о происхождении этих ферментов, изучили основы принципа их действия, увидели, как подготовить реакцию расщепления, и узнали о применении рестриктаз в молекулярной биологии. Как всегда, спасибо за просмотр!