Молекулярное клонирование

Молекулярное клонирование представляет собой совокупность методов, используемых для вставки рекомбинантной ДНК из прокариотического или эукариотического источника в реплицирующий вектор, такой как плазмиды или вирусные векторы. Под клонированием понимается создание множества копий интересующего фрагмента ДНК, например, гена. В этом видео вы ознакомитесь с различными этапами молекулярного клонирования, правилами постановки процедуры и различными областями применения данного метода.

Перед началом клонирования требуются как минимум две важные молекулы ДНК. Во-первых, и самое главное, необходим фрагмент ДНК, который вы собираетесь клонировать, также называемый вставкой. Она может быть получена из прокариота, эукариота, вымершего организма или создана искусственно в лаборатории. С помощью молекулярного клонирования мы можем больше узнать о функции конкретного гена.

Во-вторых, вам понадобится вектор. Вектор — это плазмидная ДНК, используемая в молекулярной биологии в качестве инструмента для создания дополнительных копий определенного гена или получения на его основе белка. Плазмиды являются примером вектора; они представляют собой кольцевую внехромосомную ДНК, которая реплицируется бактериями.

Плазмида обычно имеет полилинкер или MCS (multiple cloning site) — область, содержащую сайты распознавания для различных рестрикционных эндонуклеаз, также известных как рестриктазы. Различные вставки могут быть встроены в плазмиду с помощью метода, называемого лигированием. Плазмидный вектор также содержит точку начала репликации (origin of replication), которая позволяет ему реплицироваться в бактериях. Кроме того, плазмида содержит ген устойчивости к антибиотику. Если бактерии встраивают плазмиду, они выживают в среде, содержащей этот антибиотик. Это позволяет проводить селекцию успешно трансформированных бактерий.

Вставка и вектор клонируются в клетку организма-хозяина; наиболее часто используемым в молекулярном клонировании является E. coli. E. coli быстро растет, широко доступна, и для нее коммерчески производится множество различных векторов клонирования. Эукариоты, такие как дрожжи, также могут использоваться в качестве организмов-хозяев для векторов.

Первым этапом общей процедуры молекулярного клонирования является получение нужной вставки, которая может быть синтезирована на основе ДНК или мРНК любого типа клеток. Затем выбираются оптимальный вектор и организм-хозяин в зависимости от типа вставки и конечной цели исследования. Для репликации вставки часто используется метод полимеразной цепной реакции, или ПЦР.

Затем с помощью серии ферментативных реакций вставка и рестрикт соединяются друг с другом и вводятся в организм-хозяина для массовой репликации. Реплицированные векторы очищают из бактерий и после рестрикции анализируют с помощью гель-электрофореза. Фрагменты, очищенные из геля, впоследствии отправляют на секвенирование, чтобы убедиться, что вставка является искомым фрагментом ДНК.

Рассмотрим более подробно процесс молекулярного клонирования. Перед началом работы за лабораторным столом необходимо тщательно спланировать стратегию клонирования. Например, любой конкретный плазмидный вектор предоставляет ограниченное количество сайтов рестрикции для вставки вставки через полилинкер (множественный сайт клонирования). Вам потребуется выбрать такие сайты рестрикции, которые отсутствуют в вашей вставке, чтобы избежать ее расщепления. Может возникнуть ситуация, когда вам придется соединить тупоконцевой фрагмент с фрагментом, имеющим липкий конец. В таком случае использование фрагмента Кленова для подготовки к тупоконцевому лигированию может стать единственным способом внедрения вставки в нужный вектор. Понимание различных инструментов молекулярного клонирования, имеющихся в вашем распоряжении, а также разработка детальной стратегии перед началом работы позволяют существенно сэкономить время.

ДНК-источник для молекулярного клонирования может быть выделена практически из любого типа клеток или образцов тканей с помощью простых методов экстракции. После выделения для амплификации вставки можно использовать ПЦР.

После амплификации вставка и вектор подвергаются расщеплению рестриктазами, также известными как рестрикционные эндонуклеазы.

После расщепления вставку и вектор разделяют в геле и очищают методом, называемым гель-очисткой. Что касается вектора, этот этап поможет отделить линеаризованную плазмиду от нерасщепленной плазмиды, которая в геле обычно выглядит как шлейф с высокой молекулярной массой.

После гель-очистки продуктов рестрикции вставка лигируется, то есть соединяется с плазмидой с помощью фермента ДНК-лигазы.

Как правило, рекомендуется проводить лигирование при соотношении вставки к вектору 3:1, что гарантирует минимальную самолигацию вектора. После подготовки смеси для лигирования на льду ее инкубируют при температуре от 14-25˚C в течение времени от 1 часа до ночи.

Затем проводится трансформация для введения плазмидного вектора в организм-хозяин, который будет его реплицировать.

После трансформации бактерии высевают на агаризованные среды с антибиотиком и инкубируют в течение ночи при 37°C. Поскольку плазмида содержит ген устойчивости к антибиотику, успешная трансформация приведет к образованию бактериальных колоний при росте на агаре в присутствии антибиотиков. Затем отдельные колонии можно отобрать с трансформированной чашки, перенести в пронумерованные пробирки с жидкой питательной средой и поместить в шейкер-инкубатор для наращивания биомассы. Небольшой объем жидкой культуры наносят на пронумерированную агаризованную среду, а остальная часть культуры направляется на очистку плазмид. Система нумерации, обозначающая принадлежность бактериальных колоний, из которых в конечном итоге будут очищены плазмиды, сохраняется на протяжении всего процесса очистки.

Образец очищенной плазмиды затем расщепляют рестриктазами. Продукт расщепления наносят на гель и проводят электрофорез, чтобы проверить наличие вставки; это подтвердит, что бактериальная колония была трансформирована плазмидой, содержащей вставку, а не самолигированной плазмидой. Бактерии, в которых подтверждено наличие плазмиды с вставкой, наращивают для дальнейшей очистки плазмид. В качестве финального этапа верификации проводят секвенирование, чтобы подтвердить, что целевой ген был клонирован.

Молекулярное клонирование может быть использовано для практически неограниченного количества целей. Например, когда матрица мРНК подвергается обратной транскрипции с образованием кДНК (комплементарной ДНК) с помощью фермента обратной транскриптазы, а затем с помощью ПЦР амплифицируется кДНК, молекулярное клонирование может быть применено для создания библиотеки кДНК — библиотеки всех генов, экспрессируемых данным типом клеток.

Молекулярное клонирование также может быть использовано для выделения серии генов или генного кластера из одного бактериального штамма и их реорганизации в плазмиды, которые затем трансформируют в другой штамм, что позволяет воссоздать целый биосинтетический путь для производства сложной молекулы.

Посредством молекулярного клонирования можно создать библиотеку мутантов, экспрессируя целевую плазмиду в специальном бактериальном штамме, который при культивировании при определенных температурах использует склонную к ошибкам полимеразу. Мутации можно охарактеризовать с помощью секвенирования. Бактерии, трансформированные мутантными генами, затем можно протестировать с использованием различных лекарственных средств или химических веществ, чтобы определить, какие бактериальные колонии развили устойчивость к препаратам.

Благодаря молекулярному клонированию в ДНК-плазмиды могут быть встроены репортерные гены; распространенным репортерным геном является зеленый флуоресцентный белок или GFP, который излучает зеленый флуоресцентный свет при воздействии УФ-излучения. Репортерный ген также может быть вставлен в альфавирус для демонстрации инфицирования комаров и трансмиссивности в клетках.

Вы только что посмотрели видео JoVE по молекулярному клонированию. Теперь вы должны понимать принципы работы молекулярного клонирования и то, как этот метод применяется в молекулярной биологии. Как всегда, спасибо за просмотр!