Микрофлюидных На чипе Захват-циклоприсоединения Реакция на Обратимо Остановите малых молекул или многокомпонентные структуры для биосенсора приложений

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы продемонстрировать быструю и обобщаемую стратегию обратимой иммобилизации малых молекул и функционализированных наночастиц на поверхности сенсорных чипов. Это достигается путем первичной иммобилизации антител против GST на поверхности датчика. В качестве второго шага улавливание антигена GST.

Функционализированный трансцикло, октиновыми или тетразинными группами, обеспечивает реакционноспособную поверхность для последующих реакций цикло-издания с низкомолекулярными производными тет-синуса или наночастицами трендовых циклооктановых конъюгатов, которые впоследствии функционализируются низкомолекулярными производными тет-синуса. Затем функционализированная поверхность может быть использована для анализа взаимодействия с желаемой солюбилизированной мишенью. На последнем этапе поверхность регенерируется, что позволяет последующим циклическим циклам захвата и связывания показать на корабле биоортогональные реакции, сохранить способность иммобилизованных малых молекул или двух функционализированных наночастиц взаимодействовать с мишенью FK BP 12 и проиллюстрировать, как этот подход может расширить спектр применения SPR.

Основное преимущество этой технологии интегрированного цикла захвата заключается в том, что она обеспечивает быструю обратимую и мобилизованную малые молекулы с контролем ориентации и плотности мобилизации I. Как правило, процесс редактирования цикла захвата может быть выполнен в течение нескольких минут, что значительно сокращает время подготовки поверхности, демонстрируя процедуру Джейсон Сэндлер, студент из нашей лаборатории, начнет эту процедуру с восьми микролитров 50 миллимолярного раствора T-C-O-N-H-S в ДМСО до 100 микролитров одного миллиграмма на миллилитр раствора GST в PBS. Встряхнув смесь при комнатной температуре в течение одного часа, удалите излишки реагента с помощью спиновой обессоливающей колонны Zeba.

Затем добавьте шесть микролитров 25 миллимолярного раствора тетра NHS Ester в DMF к 75 микролитрам одного миллиграмм на миллилитр раствора GST в PBS и встряхните смесь при комнатной температуре через один час. Разбавьте реакционную смесь 25 микролитрами PBS и очистите с помощью спиновой обессоливающей колонны. Затем добавьте 100 микролитров 50 миллимолярного раствора T-C-O-N-H-S к 150 микролитрам выделенного раствора наночастиц и встряхните смесь таким же образом, как и раньше.

После смешивания излишки реагента удалить с помощью гелевой фильтрации с помощью колонки NAP 10. Упоминается буфер PBS. Соберите цветную ленту, содержащую продукт N-P-T-C-O.

Очищенный образец перенесите в центрифужную пробирку, содержащую центробежное фильтрующее устройство с молекулярной массой 100 000. Затем сконцентрируйте образец до конечного объема примерно 150 микролитров после центрифугирования. Добавьте 50 микролитров 0,1 молярного раствора цинного ангидрида в ДМСО в раствор N-P-T-C-O.

После встряхивания смеси при комнатной температуре в течение одного часа очистите продукт N-P-T-C-O с помощью колонки NAP 10, ускользающей от PBS с помощью поверхностной плазмы в резонансном приборе, выберите иммобилизацию на проточных ячейках номер один и два в шаблоне мастера иммобилизации АМ. Модифицируйте метод Амина для активации поверхностных карбокновых групп путем введения раствора один к одному 0,4 молярного EDC и 0,1 молярного NHS в течение 480 секунд. При скорости потока 10 микролитров в минуту установите впрыск этаноламина, чтобы погасить оставшиеся активированные эфиры, на 422-е время контакта со скоростью потока 10 микролитров в минуту.

Введите название лиганда anti GST и установите ввод на время контакта 420 секунд при расходе 10 микролитров в минуту. Далее поместите приготовленные ранее флаконы с раствором в штатив для реагентов два. Убедитесь, что позиции совпадают со списком содержимого после назначения имени файла и места назначения, куда будут сохраняться данные.

Начните иммобилизацию. Отредактируйте мастер иммобилизации так, чтобы вводить только 20 микрограммов на миллилитр раствора лиганда GST в течение 420 секунд со скоростью 5 микролитров в минуту над контрольной ячейкой 1. Поместите флаконы, содержащие G-S-T-T-C-O-A ранее приготовленный 10 микромолярный раствор TERAZ olaine и регенерационный раствор, во второй штатив для реагентов.

Выберите метод ручного запуска, установите скорость потока равной пяти микролитрам в минуту и траекторию потока до ячейки потока два. Введите раствор G-S-T-T-C-O в течение 420 секунд, а затем раствор Teraz Benz Lamine в течение 600 секунд. После этого регенерируют поверхность двумя 32-ми инъекциями регенерационного раствора.

После помещения флаконов с GST TERAZ ZINE, N-P-T-C-O, теразом беламином и регенерационным раствором во второй штатив для реагентов выберите метод ручного запуска прибора, затем установите скорость потока на уровне пяти микролитров в минуту и путь потока во вторую ячейку. Введите раствор зина GST Tetra в течение 60 секунд, а затем раствор N-P-T-C-O в течение 60 секунд. Наконец, введите раствор тетрас зина беламина в течение 60 секунд.

Когда закончите, восстановите поверхность таким же образом, как и раньше. Затем выберите новый метод и введите общие параметры, которые включают сбор данных, определение скорости, отсек для проб, температуру, единицы концентрации и настройки буфера. На панели этапов анализа создайте новый этап и назовите его образцом.

Затем установите цель и подключите настройки на основе выборки на панели типов цикла, создайте новый шаг цикла и вставьте следующие команды. Захват образца регенерации один и второй образцов. Выберите команду захвата и введите G-S-T-T-C-O в качестве лиганда.

Назовите 120 секунд в качестве времени контакта, пять микролитров в минуту в качестве скорости потока. И установите путь потока в значение second. Затем выберите команду sample и введите время 182-го контакта, время диссоциации 62-го, скорость потока 30 микролитров в минуту и установите траекторию потока для обоих.

После этого выберите команду регенерации one и введите решение для регенерации. Назовите время 32-го контакта на уровне 30 микролитров в минуту и установите траекторию потока на секунду. Повторите ту же процедуру для регенерации.

Команда two выбирает, устанавливает, запускает и устанавливает путь потока на два тире один. Выберите «Далее» и заполните список образцов раствором аналита тетрабеламина и серией концентраций от 1,5 до 20 микромоляров при одном-двух разведениях. Затем выберите рядом с панелью положения стойки.

После установки флаконов с раствором в штатив для реагентов номер два, поместите серию разведения. В 96-луночной пластине. Убедитесь, что позиции совпадают со списком содержимого.

Сохраните шаблон метода и начните анализ связывания. Скажем, после выбора нового метода и общих параметров создайте и назовите образец захвата и этапы регенерации на панели этапов анализа. После этого выберите соответствующее назначение и подключите настройки базы.

Затем выберите панель типов циклов и создайте три шага цикла. Захват, отбор проб и регенерация. Дважды вставьте команду захвата в цикл захвата.

Зайдите в режим захвата одной панели. Выберите решение для захвата в качестве переменной. Затем установите время контакта на 300 секунд при скорости потока пять микролитров в минуту и установите траекторию потока на секунду на панели захвата двух.

Выберите решение для захвата в качестве переменной. Установите время контакта на 250 секунд при расходе пять микролитров в минуту и установите траекторию потока на секунду. Затем вставьте команду sample под шаг цикла выборки.

Выберите панель образцов и установите время контакта на 60 секунд. Время диссоциации до 200 секунд при расходе 30 микролитров в минуту и установка траектории расхода на обоих. Дважды вставьте команду регенерации под шагом цикла регенерации, выберите одну панель регенерации, введите решение регенерации.

Назовите время контакта 30 секунд со скоростью 30 микролитров в минуту и установите траекторию потока на секунду. Повторите ту же процедуру для регенерации. Две панели выбора, настройка, запуск и установка пути потока на две черточки, одна выборка, следующая и ввод G-S-T-T-C-O и тераза AP 1, 497 конъюгат в качестве решения для захвата, имена FKBP 12 в качестве названия образца и от 1,5 до 96 наномоляров при одном-двух разведении в качестве серии концентраций.

После помещения флаконов с раствором во второй штатив для реагентов и серии разведения в 96-луночный планшет сохраните шаблон метода и начните анализ связывания. Эффективная обратимая иммобилизация биоактивных малых молекул с контролем ориентации и плотности играет ключевую роль в разработке новых применений биосенсоров. Здесь показан мониторинг иммобилизации бензоина в режиме реального времени.

Раствор G-S-T-T-C-O вводится на предварительно иммобилизованную поверхность против GST, что приводит к повышению примерно на 400 R RU. В ответ на это вторая инъекция Teraz zine Benzo Lamine показывает быстрый рост на 15 RU в ответ. После переключения на рабочий буфер не наблюдалось диссоциации антигена дерта, что свидетельствует о стабильности структуры.

Поверхность была регенерирована на последнем этапе цикла, чтобы обеспечить возможность многократного циклического редактирования захвата. Используя эту процедуру и заменив тетразин, бензилламин фрагмент на конъюгат тераззин AP 1, 497 генерирует биоактивную поверхность, которая используется для исследований взаимодействия со своей мишенью. Нарушение взаимодействия антигена антител FK BP 12 регенерирует анти-GST поверхность, позволяя построить новую молекулярную сборку.

В этом случае после инъекции зина GST TERAZ вводится N-P-T-C-O, эффективно иммобилизуя наночастицу на поверхности сенсора. Нереакционированные группы совокупной стоимости владения на наночастицах доступны для цикло-издания с инъекционным теразином бензоламином. В качестве альтернативы для мониторинга функционализированных взаимодействий наночастиц FK BP 12 используется конъюгат TET INE AP 1, 497.

Диссоциация многокомпонентных структур не наблюдалась, что свидетельствует о стабильности и биологической активности структуры с возможностями мониторинга реакции иммобилизации и регенерации поверхности в режиме реального времени. Прямая характеристика коэффициента ассоциации KA выполнена так, как показано на рисунке. Знание кинетики реакции дает рекомендации по контролю плотности иммобилизации и важных параметров для биосенсорных анализов.

Введение увеличивающихся концентраций тераза БЕЛАМИНА или N-P-T-C-O в двух экземплярах на поверхности G-S-T-T-C-O или GST терараз-зина соответственно генерирует данные связывания. Данные связывания двух последовательных образцов аналита одинаковой концентрации на одной и той же поверхности практически невозможны, что отражает минимальную потерю связывающей способности антител. Благодаря многократным циклам захвата циклического редактирования и регенерации, программное обеспечение для оценки обеспечивает наилучший кинетический анализ для скорости реакции цикло

Мы разработали подход, который использует захват антигена антителами в сочетании с быстрыми, высокоспецифичными реакциями циклообразования между тераззином и трансциклином, что обеспечивает быструю обратимую иммобилизацию малых молекул. Для исследований на основе чипов SPR метод циклического редактирования захвата требует короткого времени контакта с концентрацией низкомолекулярных лигандов менее 10 микромоляров. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как иммобилизовать малые молекулы или многокомпонентные структуры на поверхности сенсора методом захвата цикло-издания.

Для этого важно использовать реагенты хорошего качества для реакций конъюгации и правильно настроить параметры анализа на приборе SPR.