Генерация химер лимфатических узлов для изучения происхождения стромальных клеток лимфатических узлов

Общая цель данной процедуры заключается в создании химеры жирового пакета лимфатических узлов для оценки вклада жировой ткани в формирование стромы лимфатических узлов. Сначала это достигается путем выделения лимфатических узлов у новорожденных мышей и жировых пакетов от эмбрионов мышей на 18,5-й день. Лимфатический узел удаляется из жирового пакета эмбриона и заменяется новорожденным лимфатическим узлом.

Химера жирового пакета лимфатических узлов собирается путем реассоциации, а затем культивирования одного новорожденного лимфатического узла одним эмбриональным жировым пакетом in vitro. Затем химера прививается под почечную капсулу мыши-хозяина. Через три недели после трансплантации почку собирают и извлекают химеру.

В конечном счете, вклад клеток, полученных из жировых пакетов, в строму лимфатических узлов может быть оценен с помощью проточного цитометрического и иммунофлуоресцентного микроскопического анализа. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы искали способ оценить, способствуют ли клетки жирового пакета формированию лимфатических узлов для выделения паховых лимфатических узлов новорожденных. После разрезания головы с помощью ножниц откройте тело животного от верхней части грудного отдела до нижней части живота.

После тщательного удаления всех внутренностей из брюшной полости поместите тело в 90-миллиметровую чашку Петри, содержащую среду RF 10. Поместите чашку в стерильный капюшон для культуры тканей, а затем перенесите тело в новую стерильную 90-миллиметровую чашку Петри, содержащую свежий RF 10. Затем осторожно отделите брюшину от кожи в паховой области и найдите паховые лимфатические узлы, расположенные на пересечении трех кровеносных сосудов в жировой подушке.

Аккуратно удалите лимфатические узлы, убедившись, что вся жировая ткань удалена. Затем поместите лимфатические узлы в 50-миллиметровую чашку Петри, содержащую среду RF 10, на лед, чтобы изолировать паховые жировые пакеты от эмбрионов на 18,5-й день. После удаления внутренностей, как только что продемонстрировано, промойте тела в стерильном PBS, чтобы устранить все следы крови.

Перенесите очищенные тела в свежую 90-миллиметровую чашку Петри, а затем отсоедините брюшину, локализуйте паховый лимфатический узел и удалите его, как только что продемонстрировано. Выбросьте выделенную ткань. Позаботьтесь об удалении всего лимфатического узла, чтобы избежать загрязнения химеры жирового пакета.

Затем удалите паховую жировую подушку и поместите ее в 50-миллиметровую чашку Петри, содержащую среду RF 10 на льду. Чтобы создать систему культивирования органов in vitro, сначала разрежьте немного вулкана в пленке на кусочки размером от одного до 1,5 квадратных сантиметра. Затем прокипятите губки в течение двух часов, а фильтры в течение 20 минут в дистиллированной воде и дайте им высохнуть в течение нескольких часов в колпаке для клеточных культур.

Как только материалы высохнут, поместите по одной губке в 50-миллиметровую чашку Петри, содержащую два миллилитра среды. Погрузите каждую губку в фильтрующий материал, чтобы намочить обе стороны, а затем поместите по одному фильтру на каждую систему культивирования органов in vitro на границе раздела жидкого воздуха. Затем осторожно сопоставьте одну жировую подушку эмбриона с одним новорожденным лимфатическим узлом непосредственно на верхней части каждого фильтра.

Переложите чашки Петри в прямоугольный пластиковый ящик с водой на дне и отверстиями в крышке. Приклейте крышку к коробке скотчем, оставив отверстия открытыми. Затем поместите коробку в инкубатор для клеточных культур с температурой 5% CO2 при температуре 37 градусов Цельсия.

Дайте коробке отстояться в течение двух часов, а затем заклейте отверстия в крышке скотчем. Инкубируйте ткани в течение не менее двух дней, чтобы позволить лимфатическим узлам прикрепиться к жировым пакетам, прежде чем переместить их под капсулу почки, через три-четыре недели после трансплантации. Изолируйте химера жировой подушки каждого лимфатического узла в каждой почке и рассеките лимфатические узлы.

Затем для каждого лимфатического узла используйте небольшие ножницы, чтобы сделать один разрез в ткани, чтобы помочь ферментативному пищеварению. Затем поместите по одному лимфатическому узлу в отдельные 1,5-миллилитровые эйноровые трубки, содержащие 600 микролитров буфера для пищеварения. Инкубируйте пробирки в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия на перемешивающем термоблоке, пипетируя вверх и вниз каждые 10 минут, чтобы помочь диссоциировать ткань.

Затем добавьте шесть микролитров ЭДТА в пробирки и тритируйте клеточную суспензию несколько раз, чтобы завершить диссоциацию. Затем клетки могут быть окрашены желаемыми антителами, представляющими интерес, и проанализированы с помощью проточной цитометрии для сохранения усиленного желтого флуоресцентного белка или экспрессии EYFP. Зафиксируйте лимфоузлы на три-четыре часа.

Затем для каждого лимфатического узла нанесите по одной капле холодного ОКТ-соединения на небольшой кусочек алюминиевой фольги. Избегая появления пузырьков воздуха, осторожно поместите один лимфатический узел в середину каждой капли, а затем положите фольгу на сухой лед, чтобы заморозить ткани. Затем лимфатические узлы могут быть разделены, окрашены и проанализированы с помощью флуоресцентной микроскопии.

Тщательная изоляция лимфатического узла позволяет в дальнейшем анализировать потомство EYFP-положительных жировых клеток. Крио-срезы и иммунофлуоресцентный анализ лимфатических узлов показывают, что EYFP-положительные жировые клетки мигрируют в лимфатический узел, где они способствуют потоку сети стромальных клеток GP 38 положительного E RTR семи положительных лимфатических узлов Цитометрический анализ подтверждает, что важная фракция стромальных клеток лимфатических узлов происходит от локальных EYFP-положительных клеток-предшественников жировой ткани, составляющих 30% CD 45 отрицательных G 38 положительных CD 31 отрицательных FIBROBLASTIC фракция, и 10% CD 45 отрицательный GP 38 отрицательный CD 31 положительный эндотелиальный клеточный фракция крови до 80% CD 45, отрицательный G 38 положительный CD 31 отрицательная фибробластическая фракция могут быть получены из клеток-предшественников жировой ткани, демонстрируя решающую роль, которую играет жировая ткань в поддержании роста стромы лимфатических узлов. Поэтому однажды освоил эту технику вместе с исследователем в области лимфоидного органогенеза, чтобы изучить роль различных молекул, участвующих в лимфоидной травме.