Генерация химер лимфатических узлов для изучения происхождения стромальных клеток лимфатических узлов

Общая цель данной процедуры заключается в создании химеры из жировой подушки и лимфатического узла для оценки вклада жировой ткани в формирование стромы лимфатических узлов. Это достигается путем первоначального выделения лимфатических узлов у новорожденных мышей и жировых подушек из эмбрионов мышей на 18,5 день развития. Лимфатический узел удаляется из эмбриональной жировой подушки и заменяется лимфатическим узлом новорожденного.

Химера «лимфоузел — жировая подушка» создается путем объединения одного лимфоузла новорожденного с одной эмбриональной жировой подушкой с последующим культивированием in vitro. Затем химера пересаживается под капсулу почки мыши-реципиента. Через три недели после трансплантации почку извлекают и выделяют химерный орган.

В конечном итоге вклад клеток, полученных из жировой подушки, в строму лимфатического узла можно оценить с помощью проточной цитометрии и иммунофлуоресцентного микроскопического анализа. Идея этого метода возникла у нас при поиске способа определить, участвуют ли клетки жировой подушки в формировании лимфатических узлов. Для выделения паховых лимфатических узлов новорожденных после отделения головы с помощью ножниц вскройте туловище животного, проведя разрез от верхней части грудной области до нижней части брюшной полости.

После осторожного удаления всех внутренних органов из брюшной полости поместите тело в чашку Петри диаметром 90 мм со средой RF 10. Поместите чашку в стерильный ламинарный шкаф для культивирования тканей, а затем перенесите тело в новую стерильную чашку Петри диаметром 90 мм со свежей средой RF 10. Затем аккуратно отделите брюшину от кожи в паховой области и найдите паховые лимфатические узлы, расположенные в жировой подушке на пересечении трех кровеносных сосудов.

Осторожно извлеките лимфатические узлы, убедившись, что вся жировая ткань удалена. Затем поместите лимфатические узлы в чашку Петри диаметром 50 мм со средой RF 10 на льду, чтобы изолировать паховые жировые подушечки эмбрионов 18,5-го дня развития. После удаления внутренних органов, как было только что продемонстрировано, промойте туловища в стерильном PBS, чтобы удалить все следы крови.

Перенесите очищенные тушки в новую чашку Петри диаметром 90 мм, затем отделите брюшину, найдите паховый лимфатический узел и удалите его, как было показано ранее. Удаленную ткань утилизируйте. Убедитесь, что лимфоузел удален полностью, чтобы избежать контаминации химеры жировой подушки.

Затем удалите паховую жировую подушку и поместите её в чашку Петри диаметром 50 миллиметров с питательной средой RF 10 на льду. Для подготовки системы органокультивирования in vitro сначала нарежьте оберточный материал Vulcan на кусочки размером от 1 до 1,5 квадратных сантиметров. Затем прокипятите губки в течение двух часов, а фильтры — в течение 20 минут в дистиллированной воде и оставьте их высыхать на несколько часов в ламинарном шкафу для культивирования клеток.

После высыхания материалов поместите по одной губке в чашку Петри диаметром 50 миллиметров, содержащую два миллилитра среды. Погрузите каждую губку в среду, чтобы смочить обе стороны, а затем поместите по одному фильтру в систему для культурального выращивания органов in vitro на границе раздела фаз «жидкость-воздух». Затем осторожно приложите одну эмбриональную жировую подушечку к одному лимфатическому узлу новорожденного непосредственно на поверхность каждого фильтра.

Перенесите чашки Петри в прямоугольный пластиковый контейнер с водой на дне и отверстиями в крышке. Приклейте крышку к контейнеру скотчем, оставив отверстия открытыми. Затем поместите контейнер в инкубатор для культур клеток при 37 °C и 5% CO2.

Дайте контейнеру уравновеситься в течение двух часов, затем заклейте отверстия в крышке лентой. Инкубируйте ткани не менее двух дней, чтобы лимфатические узлы успели прикрепиться к жировым подушкам перед переносом под капсулу почки через три-четыре недели после трансплантации. Выделите химеру «лимфоузел-жировая подушка» в каждой почке и препарируйте лимфатические узлы.

Затем в каждом лимфатическом узле с помощью маленьких ножниц сделайте один разрез в ткани, чтобы облегчить ферментативное расщепление. Далее поместите каждый лимфатический узел в отдельную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 600 µL буфера для дигестии. Инкубируйте пробирки в течение 30 минут при 37 °C на перемешивающем термоблоке, каждые 10 минут выполняя пипетирование вверх-вниз для содействия диссоциации ткани.

Затем добавьте в пробирки 6 µL EDTA и несколько раз пропипетируйте клеточную суспензию для завершения диссоциации. После этого клетки можно окрасить соответствующими антителами и проанализировать методом проточной цитофлуориметрии для оценки экспрессии усиленного желтого флуоресцентного белка (EYFP). Фиксируйте лимфатические узлы в течение трех-четырех часов.

Затем для каждого лимфатического узла поместите одну каплю холодного соединения OCT на небольшой кусочек алюминиевой фольги. Избегая образования пузырьков воздуха, аккуратно поместите один лимфатический узел в центр каждой капли, после чего положите фольгу на сухой лед для замораживания тканей. Затем лимфатические узлы можно подвергнуть секционированию, окрашиванию и анализу с помощью флуоресцентной микроскопии.

Тщательная изоляция лимфатического узла позволяет провести дальнейший анализ потомства EYFP-положительных клеток, производных из жировой ткани. Криосрезы и иммунофлуоресцентный анализ лимфатического узла показывают, что EYFP-положительные клетки, производные из жировой ткани, мигрируют в лимфатический узел, где они вносят вклад в сеть стромальных клеток лимфатического узла, положительных по GP 38 и ER-TR7. Проточный цитометрический анализ подтверждает, что значительная часть стромальных клеток лимфатического узла происходит из локальных EYFP-положительных клеток-предшественников жировой ткани, которые составляют 30% CD 45-отрицательной GP 38-положительной CD 31-отрицательной фибробластической фракции и 10% CD 45-отрицательной GP 38-отрицательной CD 31-положительной фракции эндотелиальных клеток сосудов. До 80% CD 45-отрицательной GP 38-положительной CD 31-отрицательной фибробластической фракции могут происходить из клеток-предшественников жировой ткани, что демонстрирует ключевую роль жировой ткани в поддержании роста стромы лимфатического узла. Таким образом, освоение этой методики позволит исследователю в области органогенеза лимфоидных органов изучить роль различных молекул, участвующих в формировании лимфоидной стромы.