Роман Paradigm причинение легкого для использования в сетчатке Исследования Регенерация в взрослых данио рерио

Общая цель данной процедуры заключается в объединении двух ранее описанных протоколов светоиндуцированной ретинальной дегенерации для повреждения как палочек, так и колбочек-фоторецепторов по всей сетчатке. Это достигается путем первоначального воздействия УФ-излучения на взрослых зебрадани, адаптированных к темноте, в течение 30 минут. На втором этапе рыб, подвергнутых воздействию УФ-излучения, немедленно переносят в аквариумы, окруженные четырьмя галогенными лампами мощностью 250 Вт, и подвергают воздействию непрерывного света в течение до четырех дней.

Заключительным этапом является эвтаназия рыб и извлечение ядер из глаз для дальнейшего анализа. В конечном итоге используется иммунофлуоресцентная микроскопия, чтобы продемонстрировать стойкую потерю как палочковых, так и колбочковых фоторецепторов по всей сетчатке. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как воздействие УФ-излучения или галогеновых ламп, является то, что сочетание этих двух методов приводит к абляции как палочковых, так и колбочковых фоторецепторов во всей сетчатке.

Повреждение фоторецепторов вызывает широкомасштабный пролиферативный ответ, который в конечном итоге приводит к регенерации утраченных фоторецепторов. Эту методику продемонстрирует Дженнифер Томас, аспирантка моей лаборатории. Для начала используйте стеклянную чашку Петри диаметром 15 сантиметров, перевернув ее и используя в качестве подставки; закрепите ее скотчем на лабораторном столе для последующего облучения УФ-светом.

Извлеките нить УФ-лампы из флуоресцентного стереомикроскопа. Затем закрепите нить УФ-лампы скотчем над перевернутой чашкой Петри так, чтобы конец нити выступал за край чашки Петри примерно на два миллиметра. После этого оберните алюминиевой фольгой половину нижних боковых сторон и заднюю часть стеклянного стакана объемом 250 milliliter, убедившись, что блестящая сторона фольги обращена внутрь стакана.

Затем налейте в стакан 100 milliliters воды из системы рыбоводного комплекса. Поместите этот стакан в стакан объемом четыре литра. Затем наполните четырехлитровый стакан водой так, чтобы уровень воды сравнялся с отметкой 100 milliliters в стакане объемом 250 milliliters.

Поместив не более 10 рыб, подвергнутых воздействию темноты, в стакан объемом 250 milliliter, накройте стакан объемом 250 milliliter небольшим кусочком алюминиевой фольги. Затем установите всю конструкцию со стаканом в непосредственной близости от УФ-нити. Нить должна касаться внешней стенки стакана объемом 4 liter и быть направлена на открытую часть стакана объемом 250 milliliter.

Убедитесь, что стакан объемом 250 мл расположен по центру дна стакана объемом 4 л. Затем установите за стаканом объемом 4 л большой непрозрачный экран, который обеспечит доступ к животным, но скроет от персонала лаборатории кончик УФ-нити. После этого включите источник УФ-излучения.

Установите таймер на 30 минут и разместите необходимые предупреждающие знаки, чтобы другие сотрудники лаборатории случайно не подверглись воздействию УФ-излучения. По истечении 30 минут выключите источник УФ-излучения. Затем извлеките стакан объемом 250 milliliter с рыбами.

В данной процедуре перенесите рыбу из стакана объемом 250 milliliter в прозрачный акриловый аквариум объемом 1.8 liter. Затем наполните аквариум до отметки перелива, чтобы подготовить зону обработки галогенными лампами. Разместите две галогенные хозяйственные лампы мощностью 250 Вт в одном направлении на расстоянии 29 centimeters от аквариума.

Затем аналогичным образом установите две другие лампы с противоположной стороны, оставив расстояние около 73 сантиметров между двумя группами ламп. После этого разместите вентилятор на равном расстоянии между двумя группами ламп непосредственно за пределами зоны светового воздействия. Затем установите в центре зоны светового воздействия два резервуара объемом 1.8 литра, наполненных водой, на равном расстоянии между двумя группами ламп.

Затем поместите аэратор в каждый резервуар. Накройте каждый резервуар прозрачными акриловыми крышками, оставив зазор в 2 см с той стороны, которая обращена к вентилятору. Расположите вентилятор так, чтобы поток воздуха был направлен в этот зазор, и поместите термометр в один или в оба резервуара.

Затем включите питание освещения, вентилятора и аэраторов. Продолжайте воздействие светом в течение четырех дней. В период световой обработки рыб кормить не следует, так как это повлияет на качество воды и приведет к усилению стресса у животных.

Ежедневно контролируйте температуру и уровень воды, поддерживая температуру в диапазоне от 30 до 33 °C. При необходимости отрегулируйте скорость вентилятора и расстояние между резервуарами и освещением. Также ежедневно доливайте в каждый резервуар системную воду.

Через 48 часов после начала обработки галогенным светом извлеките рыб из зоны обработки. Затем приготовьте свежий раствор этанола и формальдегида для фиксации; подвергните зебраданио эвтаназии путем введения избыточной дозы анестетика триэтоксиэтанола. После этого перенесите эвтаназированных рыб на бумажное полотенце, а затем проведите энуклеацию глаза с помощью изогнутого пинцета.

Выдержите нуклеированные глаза в фиксаторе в течение ночи при температуре 4 °C для криоконсервации. Обеспечьте сохранность глаз. Промойте их в 5% sucrose 1×PBS в течение 30 минут при комнатной температуре.

Затем замените раствор на свежий 1X PBS с 5% сахарозой и выдержите глаза в течение двух часов. По истечении двух часов промойте глаза в 1X PBS с 30% сахарозой и оставьте на ночь при температуре 4 °C. На следующий день промойте глаза в смеси среды для замораживания тканей и раствора 1X PBS с 30% сахарозой в соотношении 1:1 и оставьте на ночь при температуре 4 °C.

После этого поместите глаза в 100% среду для замораживания тканей, ориентировав их по дорсо-вентральной оси. Затем храните их при температуре -80 °C не менее двух часов перед криосекционированием ткани. Выполните криосекционирование ткани и поместите срезы на предметные стекла.

Затем выдержите предметные стекла при температуре 55 °C в течение двух часов. После этого храните стекла при температуре -80 °C или сразу приступайте к стандартному иммуногистохимическому анализу и визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии. На данном рисунке показаны изменения пролиферативного ответа после воздействия различных моделей светового повреждения.

Представлены срезы сетчатки взрослой альбинозной зебрафиш, иммуноокрашенные на PCNA для демонстрации пролиферации клеток (отмечена красным) в дорсальной и вентральной половинах сетчатки через 0 часов после различных парадигм светового повреждения. Пролиферация отсутствовала в интерклеточном слое через 48 HLT. Одиночные клетки-предшественники присутствовали в INL по всей дорсальной сетчатке и в небольшой части вентральной сетчатки.

Через 48 часов после начала развития (HPUV). В дорсальной сетчатке наблюдались колонки клеток-предшественников, в то время как в небольшой части вентральной сетчатки присутствовали лишь одиночные клетки-предшественники. Через 48 часов после UV наблюдались крупные колонки клеток-предшественников во всей дорсальной и вентральной сетчатке.

На этом рисунке показана потеря палочковых и колбочковых фоторецепторов у пигментированных рыб-зебр после применения различных моделей светового повреждения. Представлены срезы сетчатки, окрашенные Propidium Iodide (Pro PI) для визуализации ядер синим цветом и иммуноокрашенные zpr R3 для визуализации наружных сегментов палочек пурпурным цветом или zpr R1 для визуализации двойных колбочек золотистым цветом после каждой из моделей светового повреждения. Значительное снижение количества ядер палочковых фоторецепторов наблюдалось в дорсальной части сетчатки через 48 HLT, а также в дорсальной и вентральной частях сетчатки при UV плюс 48 HLT.

Несмотря на гипертрофию ядер в дорсальной части сетчатки через 48 HPUV, значимого снижения количества ядер двойных колбочек не наблюдалось ни через 48 HLT, ни через 48 HPUV. Значительное снижение количества ядер было отмечено в дорсальной и вентральной частях сетчатки через восемь H lt после UB. Сочетание этого метода с другими подходами, такими как использование ген-специфических фармакологических ингибиторов или нокдаун белков in vivo, позволяет выявить роль отдельных генов в дегенерации фоторецепторов и последующем регенераторном ответе.