Выражение функциональных рекомбинантного гемагглютинина и нейраминидазы белков от вируса H7N9 Роман гриппа Используя выражение бакуловирусной системе
6 ноября 2013 г.
Здесь мы опишем способ выразить правильно сложенные и функциональные поверхностные антигены вируса гриппа, полученные из романа китайского вируса H7N9 в клетках насекомых. Этот метод может быть адаптирован, чтобы выразить эктодомены любых вирусных или клеточных поверхностных белков.
Общая цель этой процедуры заключается в получении правильно сложенного очищенного гликопротеина гриппа, гемагглютинина и нейраминидазы для иммунологических анализов и экспериментов по вакцинации. Это достигается путем клонирования рекомбинантного BMid, несущего гены гриппа, с последующим получением рекомбинантных вирусов баула. Второй шаг заключается в использовании этих рекомбинантных вирусов баулы для экспрессии белков гемагглютинина и нейраминидазы в клетках насекомых.
Затем рекомбинантные белки очищают от надосадочной жидкости клеточной культуры с помощью аффинной хроматографии. Последним шагом является характеристика этих белков для обеспечения хорошего качества и биологической функциональности. В конечном счете, рекомбинантные белки используются для исследования иммунных реакций на поверхностные гликопротеины вируса гриппа.
Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как, например, бактериальная экспрессия ГК, заключается в том, что очищенные антигены являются корректирующими и также остаются биологически активными, в отличие от использования цельновирусных препаратов для иммунологических анализов. Эти реагенты позволяют измерять иммунные реакции против гемагглютинина и белков, не содержащих нейраминидазу. Только начните этот протокол с генерации рекомбинантного вируса баула, как описано в текстовом протоколе, работающего асептически в пластине с ламинарным потоком, SF девяти клеток насекомого в шести луночных планшетах с плотностью 200 000 клеток на квадратный сантиметр.
И давайте посидим 20 минут в инкубаторе при температуре 28 градусов по Цельсию без СО2. Затем смешайте два микрограмма рекомбинантной средней части тела со 100 микролитрами Trico Leia коленной среды HINK или TNM fh. Затем смешайте шесть микролитров средства для переделки со 100 микролитрами среды от насекомых TNM FH.
Соедините два объема, аккуратно перемешайте и оставьте смесь для переливания на 20 минут. При комнатной температуре включают одну имитацию трансфекции в качестве контроля, которая содержит реагент для трансфекции, но не содержит ДНК. Удалите SNAT из покрытых SF девяти клеток и замените их двумя миллилитрами свободной сыворотки среды TNM FH, содержащей 1% раствор пенициллина стрептомицина.
Добавьте весь объем трансфекционной смеси в ячейки и осторожно покачивайте шестилуночную пластину в течение пяти секунд. Инкубируйте в инкубаторе с температурой 28 градусов Цельсия без CO2 в течение шести часов. Замените среду на свежую полную среду TNM FH перед инкубацией планшета в тех же условиях в течение шести дней.
Время от времени проверяйте клетки под микроскопом. Инфицированные клетки обычно выглядят больше. Округлители имеют увеличенные ядра и начинают отделяться.
Соберите клетки через шесть дней после трансфекции центрифугированием при температуре 2000 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Надосадочная жидкость содержит рекомбинантный вирус баула и будет использоваться для создания рабочих запасов сразу или может храниться при температуре четыре градуса Цельсия в течение многих лет. Проверьте экспрессию белка с помощью SDS page и вестерн-блоттинга и подготовьте рабочие запасы, как описано в текстовом протоколе.
SF девять клеток очень хорошо поддерживают рост макулярного вируса. Однако их способность выделять большое количество рекомбинантного белка ограничена. Поэтому мы используем другую клеточную линию насекомых.
Высокая пятерка клеток для экспрессии секретируемых рекомбинантных белков. Эти клетки не поддерживают рост баловируса до высоких титров, но обладают очень высокой секреторной способностью. Выращивайте высокие пять клеток в среде для культивирования клеток насекомых SFX в колбах площадью 175 квадратных сантиметров через день.
Разделяем их в соотношении один к трем. Вырастите пять конфлюентных колб для получения культуры экспрессии объемом 200 миллилитров, чтобы собрать и заразить пять клеток. Сначала отсоедините пять ячеек, постукивая по колбам.
Соберите клеточную суспензию и переложите в центрифужные пробирки объемом 50 миллилитров. Вращайте трубки при температуре 1200 G в течение семи минут при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость путем сцеживания и соедините гранулы методом ресус, суспендируя их в 15 миллилитрах трех запасов.
Дайте ячейкам постоять 15 минут в проточном колпаке. Перелейте 200 миллилитров питательной среды с высоким клонированием SFX в чистую стерильную колбу объемом 1000 миллилитров. Затем перенесите трехэлементную суспензию P в уплотнение колбы шейкера со стерильной алюминиевой фольгой перед встряхиванием при 70 об/мин и 28 градусах Цельсия в течение 72-96 часов.
Для сбора рекомбинантного белка из надосадочной жидкости с высокой экспрессией пяти клеток через 72–96 часов после заражения. Перелейте надосадочную жидкость культуры в ведра центрифугирования объемом 500 миллилитров. Вращайте при температуре 5 500 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.
Тем временем трижды промойте колбу шейкера двойной дистиллированной водой. Далее пипетка. Три миллилитра суспензии никелевой смолы в 50-миллилитровую пробирку с 45 миллилитрами PBS на 200 миллилитров культуры.
Хорошо встряхните перед отжимом в течение 10 минут при 3000 G и комнатной температуре после центрифугирования. Сцедите PBS и оставьте гранулы. Смешайте надосадочную жидкость для клеток насекомых с гранулой никелевой смолы и переложите в уже промытые колбы шейкера.
Выдерживайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух-четырех часов, встряхивая. Далее монтируем полипропиленовую колонну объемом 10 миллилитров на хомут к опорной стойке. Снимите обе крышки и поместите стакан под колонну, чтобы собрать поток.
После инкубации колбы шейкера начните перекачивать надосадочную смесь суспензии на колонну. Он сохранит никелевую смолу, и через него будет протекать только надосадочная жидкость. Пропустите весь объем по столбцу.
Промойте смолу четыре раза 15 миллилитрами промывочного буфера. Дайте промывочному буферу стечь из колонны и закройте нижнюю сторону крышкой. Добавьте два миллилитра элуцианского буфера и посидите пять минут.
Откройте колонку и соберите eit, по возможности держа его на мокром льду. Повторите это еще три раза. ЭИТ, содержащая высокие концентрации белка, обычно образует пену при встряхивании для замены буфера и концентрации белка в свободном отжиме 15-миллилитровых ультрафильтрационных центрифугаторов с PBS при 3000 G и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут.
Отбросьте поток и загрузите EIT на спиновую колонну. Заполните колонку пятью миллилитрами стерильного ледяного PBS перед вращением в тех же условиях в течение 60 минут. Снова выпустите поток, залейте 15 миллилитров ледяного PBS и крутите еще 60 минут.
Повторите эту процедуру еще раз, затем соберите буферный концентрат, который представляет собой высококонцентрированный рекомбинантный белок. Всегда держите концентрацию на льду. Промойте спиновую колонку 400 микролитрами стерильного ледяного PBS и добавьте это в концентрат.
Затем белок может быть охарактеризован так, как описано в текстовом протоколе. Белки HA и NA, экспрессируемые штаммами ENUE и Shanghai, показали умеренные уровни экспрессии в диапазоне от 0,2 мг на литр культуры для гриппа А, собранной в Шанхае, до 0,7 мг на литр для гриппа. Молекулы A, нейраминидазы или NA обоих штаммов показали умеренные уровни экспрессии в диапазоне от 0,2 мг на литр культуры гриппа А, собранной в Шанхае, до 0,7 мг на литр для вируса гриппа А, собранного в энуэ.
Все четыре белковых препарата содержали очень мало или вообще не содержали примесей, причем ha's имел более высокую чистоту, чем nas, что можно объяснить уровнем экспрессии. Грипп А, собранный в Шанхайской HA, был дополнительно проанализирован с использованием ELI SA с широко нейтрализующим стебель реактивным человеческим моноклональным антителом CR 9 1 1 4. Как показано здесь синим цветом, это моноклональное антитело связывается с чувствительным подтверждающим эпитопом в стоковом домене и используется здесь в качестве зонда для правильного сворачивания этого домена.
Антитело демонстрирует хорошее связывание, о чем свидетельствует повышенная абсорбция на 490 нанометрах, что дает уверенность в том, что ГК действительно сворачивается правильно. Второе, Элиза с антигемагглютинином поликлональной сыворотки мышей подтипа семь было проведено для подтверждения идентичности полученного белка как гемагглютинина подтипа седьмого происхождения. После просмотра этого видео у вас будет хорошее понимание того, как экспрессировать рекомбинантный вирус гриппа, гемагглютинин и белки нейраминидазы в вашей лаборатории.
Этот процесс также может быть полезен для экспрессии других вирусных или клеточных мембранных белков. Желаю вам удачи в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод экспрессии правильно свернутых и функциональных поверхностных антигенов вируса гриппа штамма H7N9 в клетках насекомых. Этот подход может быть адаптирован для экспрессии различных вирусных или клеточных поверхностных белков.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Вирусология
- Иммунология
- Белковая инженерия
Теоретические основы
- Поверхностные гликопротеины вируса гриппа имеют решающее значение для исследований иммунного ответа.
- Правильный фолдинг и функциональность этих белков необходимы для их использования в анализах.
- Вирус H7N9 создает уникальные трудности и возможности для исследований.
- Системы клеток насекомых представляют собой жизнеспособную платформу для экспрессии белков.
Цель исследования
- Для получения очищенных белков гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа.
- Для проведения иммунологических анализов и экспериментов по вакцинации.
- Для изучения иммунных ответов на поверхностные гликопротеины вируса гриппа.
Используемые методы
- Клонирование рекомбинантного BMid, несущего гены гриппа.
- Создание рекомбинантных вирусов баула.
- Экспрессия гемагглютинина и нейраминидазы в клетках насекомых.
- Очистка белков с помощью аффинной хроматографии.
Основные результаты
- Успешная экспрессия и очистка поверхностных гликопротеинов вируса гриппа.
- Характеризация подтвердила качество и функциональность белков.
- Белки были эффективно использованы для изучения иммунного ответа.
- Данный метод может быть адаптирован для других вирусных или клеточных белков.
Выводы
- Описанный метод эффективен для получения функциональных антигенов гриппа.
- Он закладывает основу для дальнейших иммунологических исследований.
- Данный подход может быть применен к различным поверхностным белкам, помимо белков гриппа.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Рекомбинантные белки гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа являются критически важными реагентами для иммунологических анализов, стандартизации вакцин и скрининга противовирусных препаратов. Система экспрессии на основе бакуловирусов позволяет получать правильно свернутые гликозилированные антигены, сохраняющие биологическую функцию, что обеспечивает надежную валидацию мишеней и идентификацию перспективных соединений для терапии гриппа. Данный подход снижает зависимость от препаратов цельного вируса и ускоряет доклиническую оценку рисков при разработке кандидатов в антитела и низкомолекулярных ингибиторов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, предоставляя правильно свернутые антигены HA и NA для исследований по связыванию антител и картированию эпитопов.
- Операционная ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней с помощью анализов, измеряющих ингибирование гемагглютинации и ферментативную активность нейраминидазы.
- Прогностическая ценность: облегчает отбор проектов в портфеле за счет создания реагентов для оценки перекрестной реактивности и широты нейтрализации моноклональных антител.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Позволяет получать стандартизированные антигены для анализов ELISA и ELISPOT для количественного определения иммунного ответа на поверхностные гликопротеины гриппа.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность высокопроизводительного скрининга низкомолекулярных ингибиторов с использованием рекомбинантной нейраминидазы в анализах ферментативной активности.
- Масштабируемость: Поддерживает крупномасштабное производство белков для обеспечения реагентами рабочих процессов по поиску антител и стандартизации вакцин.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает получение соответствующих заболеванию антигенов для доклинической оценки кандидатов в вакцины и терапевтических антител на моделях животных.
- Снижение механистических рисков: подтверждает правильность фолдинга и гликозилирования HA, что сокращает количество ложноотрицательных результатов при иммунологическом анализе.
- Согласованность доклинических моделей: обеспечивает стабильное снабжение антигенами на этапах поиска и доклинических исследований для профилирования иммунного ответа.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум разработки лекарственных средств — от валидации мишени и идентификации лидерных соединений до доклинической оценки, обеспечивая получение рекомбинантных антигенов для иммунологического профилирования и изучения механизмов действия.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез путем предоставления функциональных белков HA и NA для анализов иммунного вмешательства и связывания с рецепторами.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа благодаря использованию очищенной активной нейраминидазы для скрининга чувствительности к противовирусным препаратам и гемагглютинина для анализов захвата антител.
- Аналитика: позволяет получать количественные показатели, такие как оптическая плотность в ELISA и титры гемагглютинации, для сравнения иммунных ответов при различных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность доклинических исследований, предоставляя антигены, используемые в исследованиях эффективности вакцин и антительной защиты на моделях животных.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для экспрессии поверхностных белков гриппа и других вирусов в рамках нескольких проектов и сезонов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при оценке антигенности за счет получения правильно свернутых, посттрансляционно модифицированных гликопротеинов гриппа.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость и масштабируемость производства антигенов с использованием систем клеток насекомых с определенными протоколами очистки.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») при оптимизации ведущих антител за счет снижения механистической неопределенности в данных по связыванию и нейтрализации.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять продвижение вакцин и терапевтических кандидатов с поправкой на риск за счет стандартизированного снабжения антигенами кросс-функциональных групп.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области молекулярного клонирования, получения бакуловирусов и методов культивирования клеток насекомых.
- Необходим доступ к реагентам для трансфекции, системам никель-аффинной хроматографии и центрифугам для очистки белков.
- Требуется стандартизация процессов между исследовательскими группами для обеспечения стабильного выхода, чистоты белков и согласованности тестов на функциональную активность.
- При адаптации метода следует учитывать оптимизацию множественности заражения и времени сбора для различных штаммов гриппа или целевых белков.
- Практические ограничения включают вариабельность уровней экспрессии у разных штаммов и необходимость функциональной валидации, выходящей за рамки SDS-PAGE и вестерн-блоттинга.
