Выражение функциональных рекомбинантного гемагглютинина и нейраминидазы белков от вируса H7N9 Роман гриппа Используя выражение бакуловирусной системе

Общая цель этой процедуры заключается в получении правильно сложенного очищенного гликопротеина гриппа, гемагглютинина и нейраминидазы для иммунологических анализов и экспериментов по вакцинации. Это достигается путем клонирования рекомбинантного BMid, несущего гены гриппа, с последующим получением рекомбинантных вирусов баула. Второй шаг заключается в использовании этих рекомбинантных вирусов баулы для экспрессии белков гемагглютинина и нейраминидазы в клетках насекомых.

Затем рекомбинантные белки очищают от надосадочной жидкости клеточной культуры с помощью аффинной хроматографии. Последним шагом является характеристика этих белков для обеспечения хорошего качества и биологической функциональности. В конечном счете, рекомбинантные белки используются для исследования иммунных реакций на поверхностные гликопротеины вируса гриппа.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как, например, бактериальная экспрессия ГК, заключается в том, что очищенные антигены являются корректирующими и также остаются биологически активными, в отличие от использования цельновирусных препаратов для иммунологических анализов. Эти реагенты позволяют измерять иммунные реакции против гемагглютинина и белков, не содержащих нейраминидазу. Только начните этот протокол с генерации рекомбинантного вируса баула, как описано в текстовом протоколе, работающего асептически в пластине с ламинарным потоком, SF девяти клеток насекомого в шести луночных планшетах с плотностью 200 000 клеток на квадратный сантиметр.

И давайте посидим 20 минут в инкубаторе при температуре 28 градусов по Цельсию без СО2. Затем смешайте два микрограмма рекомбинантной средней части тела со 100 микролитрами Trico Leia коленной среды HINK или TNM fh. Затем смешайте шесть микролитров средства для переделки со 100 микролитрами среды от насекомых TNM FH.

Соедините два объема, аккуратно перемешайте и оставьте смесь для переливания на 20 минут. При комнатной температуре включают одну имитацию трансфекции в качестве контроля, которая содержит реагент для трансфекции, но не содержит ДНК. Удалите SNAT из покрытых SF девяти клеток и замените их двумя миллилитрами свободной сыворотки среды TNM FH, содержащей 1% раствор пенициллина стрептомицина.

Добавьте весь объем трансфекционной смеси в ячейки и осторожно покачивайте шестилуночную пластину в течение пяти секунд. Инкубируйте в инкубаторе с температурой 28 градусов Цельсия без CO2 в течение шести часов. Замените среду на свежую полную среду TNM FH перед инкубацией планшета в тех же условиях в течение шести дней.

Время от времени проверяйте клетки под микроскопом. Инфицированные клетки обычно выглядят больше. Округлители имеют увеличенные ядра и начинают отделяться.

Соберите клетки через шесть дней после трансфекции центрифугированием при температуре 2000 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Надосадочная жидкость содержит рекомбинантный вирус баула и будет использоваться для создания рабочих запасов сразу или может храниться при температуре четыре градуса Цельсия в течение многих лет. Проверьте экспрессию белка с помощью SDS page и вестерн-блоттинга и подготовьте рабочие запасы, как описано в текстовом протоколе.

SF девять клеток очень хорошо поддерживают рост макулярного вируса. Однако их способность выделять большое количество рекомбинантного белка ограничена. Поэтому мы используем другую клеточную линию насекомых.

Высокая пятерка клеток для экспрессии секретируемых рекомбинантных белков. Эти клетки не поддерживают рост баловируса до высоких титров, но обладают очень высокой секреторной способностью. Выращивайте высокие пять клеток в среде для культивирования клеток насекомых SFX в колбах площадью 175 квадратных сантиметров через день.

Разделяем их в соотношении один к трем. Вырастите пять конфлюентных колб для получения культуры экспрессии объемом 200 миллилитров, чтобы собрать и заразить пять клеток. Сначала отсоедините пять ячеек, постукивая по колбам.

Соберите клеточную суспензию и переложите в центрифужные пробирки объемом 50 миллилитров. Вращайте трубки при температуре 1200 G в течение семи минут при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость путем сцеживания и соедините гранулы методом ресус, суспендируя их в 15 миллилитрах трех запасов.

Дайте ячейкам постоять 15 минут в проточном колпаке. Перелейте 200 миллилитров питательной среды с высоким клонированием SFX в чистую стерильную колбу объемом 1000 миллилитров. Затем перенесите трехэлементную суспензию P в уплотнение колбы шейкера со стерильной алюминиевой фольгой перед встряхиванием при 70 об/мин и 28 градусах Цельсия в течение 72-96 часов.

Для сбора рекомбинантного белка из надосадочной жидкости с высокой экспрессией пяти клеток через 72–96 часов после заражения. Перелейте надосадочную жидкость культуры в ведра центрифугирования объемом 500 миллилитров. Вращайте при температуре 5 500 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.

Тем временем трижды промойте колбу шейкера двойной дистиллированной водой. Далее пипетка. Три миллилитра суспензии никелевой смолы в 50-миллилитровую пробирку с 45 миллилитрами PBS на 200 миллилитров культуры.

Хорошо встряхните перед отжимом в течение 10 минут при 3000 G и комнатной температуре после центрифугирования. Сцедите PBS и оставьте гранулы. Смешайте надосадочную жидкость для клеток насекомых с гранулой никелевой смолы и переложите в уже промытые колбы шейкера.

Выдерживайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух-четырех часов, встряхивая. Далее монтируем полипропиленовую колонну объемом 10 миллилитров на хомут к опорной стойке. Снимите обе крышки и поместите стакан под колонну, чтобы собрать поток.

После инкубации колбы шейкера начните перекачивать надосадочную смесь суспензии на колонну. Он сохранит никелевую смолу, и через него будет протекать только надосадочная жидкость. Пропустите весь объем по столбцу.

Промойте смолу четыре раза 15 миллилитрами промывочного буфера. Дайте промывочному буферу стечь из колонны и закройте нижнюю сторону крышкой. Добавьте два миллилитра элуцианского буфера и посидите пять минут.

Откройте колонку и соберите eit, по возможности держа его на мокром льду. Повторите это еще три раза. ЭИТ, содержащая высокие концентрации белка, обычно образует пену при встряхивании для замены буфера и концентрации белка в свободном отжиме 15-миллилитровых ультрафильтрационных центрифугаторов с PBS при 3000 G и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут.

Отбросьте поток и загрузите EIT на спиновую колонну. Заполните колонку пятью миллилитрами стерильного ледяного PBS перед вращением в тех же условиях в течение 60 минут. Снова выпустите поток, залейте 15 миллилитров ледяного PBS и крутите еще 60 минут.

Повторите эту процедуру еще раз, затем соберите буферный концентрат, который представляет собой высококонцентрированный рекомбинантный белок. Всегда держите концентрацию на льду. Промойте спиновую колонку 400 микролитрами стерильного ледяного PBS и добавьте это в концентрат.

Затем белок может быть охарактеризован так, как описано в текстовом протоколе. Белки HA и NA, экспрессируемые штаммами ENUE и Shanghai, показали умеренные уровни экспрессии в диапазоне от 0,2 мг на литр культуры для гриппа А, собранной в Шанхае, до 0,7 мг на литр для гриппа. Молекулы A, нейраминидазы или NA обоих штаммов показали умеренные уровни экспрессии в диапазоне от 0,2 мг на литр культуры гриппа А, собранной в Шанхае, до 0,7 мг на литр для вируса гриппа А, собранного в энуэ.

Все четыре белковых препарата содержали очень мало или вообще не содержали примесей, причем ha's имел более высокую чистоту, чем nas, что можно объяснить уровнем экспрессии. Грипп А, собранный в Шанхайской HA, был дополнительно проанализирован с использованием ELI SA с широко нейтрализующим стебель реактивным человеческим моноклональным антителом CR 9 1 1 4. Как показано здесь синим цветом, это моноклональное антитело связывается с чувствительным подтверждающим эпитопом в стоковом домене и используется здесь в качестве зонда для правильного сворачивания этого домена.

Антитело демонстрирует хорошее связывание, о чем свидетельствует повышенная абсорбция на 490 нанометрах, что дает уверенность в том, что ГК действительно сворачивается правильно. Второе, Элиза с антигемагглютинином поликлональной сыворотки мышей подтипа семь было проведено для подтверждения идентичности полученного белка как гемагглютинина подтипа седьмого происхождения. После просмотра этого видео у вас будет хорошее понимание того, как экспрессировать рекомбинантный вирус гриппа, гемагглютинин и белки нейраминидазы в вашей лаборатории.

Этот процесс также может быть полезен для экспрессии других вирусных или клеточных мембранных белков. Желаю вам удачи в ваших экспериментах.