Выделение кровеносных сосудов, полученных мультипотентные прекурсоров от человека скелетных мышц

Общая цель данной процедуры заключается в выделении и очистке подмножеств мультипотентных клеток-предшественников, полученных из кровеносных сосудов человека, из единичного биоптата скелетной мышцы. Сначала биоптат мышцы подвергают диссоциации и перевариванию с использованием комбинации коллагеназ типов один, два и четыре. Затем суспензию одиночных клеток маркируют конъюгированными с флуорохромом антителами, которые распознают комбинацию определенных маркеров клеточной поверхности. После этого проводят сортировку клеток с помощью потоковой цитометрии с флуоресцентно-активированным разделением.

Визуализируйте и изучите расширение отсортированных подтипов клеток в специфических условиях культивирования при оптимальной плотности. В конечном итоге, анализ очищенных клеток после сортировки, а также последующая проточная цитометрия и анализ методом R-T-P-C-R культивируемых субпопуляций клеток используются для подтверждения чистоты этих гомогенных субпопуляций BVSE. Таким образом, этот метод позволяет ответить на вопрос о происхождении мезенхимальных стволовых клеток верблюда.

Как известно, многие исследователи обнаружили различные типы стволовых клеток в разных тканях. Поэтому я полагаю, что данный подход может дать ответ на вопрос о происхождении этих стволовых клеток, а также о роли периваскулярных и любых других клеток, производных от кровеносных сосудов, в регенерации и восстановлении тканей. Визуальная демонстрация этого метода крайне важна, так же как и проведение биопсии мышц.

Этапы диссоциации могут быть сложными в освоении. Технические детали и оптимизация переваривания коллагеназой имеют решающее значение для выхода и очистки целевых клеток. Транспортируйте биоптат скелетных мышц человека на льду.

В среде DM M с добавлением 5% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина в стерильных условиях. Промойте образец дважды в PBS, содержащем 2% антибиотика и антимикотика, затем в dms с добавлением 2% aa. Удалите прикрепленную жировую и соединительную ткани.

Также удалите крупные кровеносные сосуды под диссекционным микроскопом. Затем разрежьте образец мышцы на мелкие фрагменты. Перенесите образцы в 20 milliliters консервирующей среды для хранения при температуре four degrees Celsius в течение периода до пяти дней.

В день выделения клеток извлеките фрагменты мышц и дважды промойте их в PBS с добавлением 2% pen strip. Для приготовления раствора для переваривания добавьте в PM коллагеназы типов 1, 2 и 4 в концентрации 100 mg/mL каждой.

Наконец, измельчите кусочки мышц и механически перетрите их с небольшим количеством pm. Пропустите раствор через серологическую пипетку объемом 10 миллилитров, контролируя отсутствие сгустков. В процессе выполнения данной операции удалите остатки жировой и соединительной тканей.

Затем перенесите половину образца взрослого организма в 20 milliliters или весь образец плода в 10 milliliters раствора для переваривания. Переваривайте образец в течение 50–60 минут при 37 °C на орбитальном шейкере при 70–80 RPM. Контролируйте статус переваривания каждые 15–20 минут.

Оптимизируйте выход клеток и сохранность поверхностных антигенов, соответствующим образом регулируя время дигестии и/или скорость перемешивания в зависимости от количества ткани; когда мутность почти исчезнет, интенсивно пропипетируйте дигестированную ткань от трех до пяти раз. Добавьте равный объем PM для остановки реакции, затем центрифугируйте при 400 Gs в течение четырех минут, осторожно удалите супернатант, чтобы промыть осадок, и ресуспендируйте его в 10 миллилитрах PM. Профильтруйте через клеточный стрейнер с размером пор 100 микрон, центрифугируйте при 400 Gs в течение четырех минут и осторожно удалите супернатант.

Затем ресуспендируйте осадок в буфере для лизиса эритроцитов и профильтруйте через клеточный фильтр с порами 70 мкм для получения суспензии одиночных клеток. После инкубации в течение 10 минут при комнатной температуре профильтруйте суспензию через клеточный фильтр 70 мкм. При обнаружении любого осадка осадите клетки путем центрифугирования и повторного ресуспендирования.

Ресуспендируйте в 0,5 мл PBS и подсчитайте количество клеток для окрашивания. Разбавьте суспензию единичных клеток с помощью порций PBS до концентрации менее 5 миллионов клеток на мл. Отберите от 50 до 100 мкл суспензии клеток и распределите по 11 пробиркам для неокрашенного контроля, отрицательных контролей и одноцветных положительных контролей. При необходимости проведите блокировку суспензии единичных клеток в течение 10 минут при 4 °C в сыворотке мыши.

Добавьте растворы антител в соответствии с планом эксперимента и инкубируйте в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Осадите клетки путем центрифугирования и один раз промойте осадок каждого образца разбавленным PM до конечной концентрации 5 миллионов клеток на миллилитр для исключения погибших клеток при разведении семь a a d в соотношении 1:100 и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре для отрицательного контроля и одноцветных положительных контролей. Ресуспендируйте клеточные осадки в 0,5 миллилитрах разбавленного pm.

Перенесите все клеточные суспензии в полистирольные пробирки с круглым дном для проточной цитометрии. Затем подготовьте пробирки для сбора клеток, добавив в каждую 500 µL соответствующей среды coer. Транспортируйте клеточные суспензии на льду к анализатору.

Проведите сортировку клеточных суспензий на клеточном сортере в следующем порядке: некрашеный контроль, отрицательные контроли, одноцветные положительные контроли и основная клеточная суспензия, при этом строго настраивая интенсивность лазера, компенсацию каналов и гейтирование популяций клеток для обеспечения максимальной чистоты клеток. Соберите интересующие популяции клеток в соответствующие пробирки для сбора. Храните собранные клетки при температуре 4 °C.

Если посев не проводится немедленно, используйте свежесортированные миогенные эндотелиальные клетки в среде MPM, высевая их на планшеты, предварительно покрытые коллагеном I типа, для последующей упаковки посева ECS.

Высевайте от 3 500 до 4 000 клеток на квадратный сантиметр в среде MPM в планшеты или флаконы, предварительно покрытые коллагеном I типа. Свежеотсортированных паразитов в среде egm two высевайте в планшеты, свежепокрытые 0,2% желатином, для первого и второго пассажей. Пересевайте клетки в соотношении 1:3 в среде PC на обычный полистирольный культуральный пластик.

Платформы, начиная с третьего пассажа (P3). Посейте клетки с плотностью от 6 500 до 7 000 клеток на квадратный сантиметр в среде PC на стандартные полистирольные культуральные планшеты. Флаконы: посейте свежеотсортированные клетки адвентной ткани в среде AC на стандартные полистирольные культуральные планшеты для последующего пассирования посевных клеток ACS с плотностью от 6 000 до 7 000 клеток на квадратный сантиметр в среде AC на стандартные полистирольные культуральные планшеты.

Параметры анализа колб сначала корректируются на основе данных, полученных от неокрашенного контроля, отрицательных контролей и одноцветных положительных контролей; после исключения мертвых клеток суспензия флуоресцентно-меченых клеток подвергается серии селекций по отрицательным и положительным маркерам клеточной поверхности. Сначала исключаются CD 45-положительные клетки. Затем из CD 45-отрицательной фракции отделяют CD 56-положительные и CD 56-отрицательные клетки.

Фракция CD 56-положительных клеток далее подвергается селекции по CD 34 и CD 1 44, при этом только двойные положительные клетки маркируются как миогенные эндотелиальные клетки и впоследствии собираются. Аналогичным образом, фракция CD 56-отрицательных клеток подвергается селекции по CD 34 и CD 1 46, где только CD 34-отрицательные CD 1 46-положительные клетки маркируются как паразиты и впоследствии собираются; фракция CD 34-положительных CD 1 46-отрицательных клеток подвергается дополнительной негативной селекции по CD 31 для исключения эндотелиальных клеток, и только подмножество CD 34-положительных CD 31-отрицательных клеток маркируется как adv-клетки для сбора. В данном случае для исключения ЭК вместо CD 31 может быть использован CD 1 44.

Данные подмножества H-P-V-S-C были очищены из биоптатов мышц одного донора. В отличие от типичных гетерогенных стволовых клеток мышц, культуры подмножеств стволовых клеток, полученных из кровеносных сосудов человека, остаются гомогенными даже после длительного экспансионного культивирования. Как вы понимаете, я считаю очень важным, чтобы другие исследователи использовали тот же метод для изоляции этих стволовых клеток, полученных из кровеносных сосудов, который мы описали в наших лабораториях.

Таким образом, мы полагаем, что параллельное использование данной методики позволит другим исследователям воспроизвести наши результаты и провести объективное сравнение данных разных групп. Не забывайте, что работа со свежими тканями человека может быть крайне опасной. При выполнении данной процедуры необходимо соблюдать меры предосторожности, такие как использование нитриловых перчаток и средств защиты глаз.