ФИБС поддержкой неинвазивной метаболического профилирования

Общая цель этой процедуры заключается в неинвазивном контроле уровня внутриклеточной глюкозы или глутамина с использованием генетически кодируемых биосенсоров на основе белка. Это достигается путем предварительного пересечения интересующих клеток геном биосенсора, содержащим плазмиду, и отбора клеток, экспрессирующих биосенсор. На втором этапе отбирают образцы клеточных культур из культур партии или скармливаемых партий и измеряют их отношения ладов.

Внутриклеточная концентрация глюкозы или глутамина в образцах может быть затем определена с помощью независимого анализа. В конечном счете, соотношение ладов образцов может быть использовано для расчета внутриклеточной концентрации глюкозы или глутамина неинвазивным способом и в режиме реального времени. Применение этого метода распространяется на улучшение биопроцессов, поскольку это надежный метод получения метаболической информации в реальном времени, которая может быть использована для онлайн-оптимизации и контроля.

Несмотря на то, что этот метод может быть использован для получения информации о биопроцессинге, он также может быть использован в других системах, включая зондирование маркеров заболеваний. Начните с оживления клеток СНО в девяти миллилитрах полной питательной среды. Затем раскрутите клетки, повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах свежего роста, среды, и подсчитайте клетки по требухе в синем кристалле.

Далее инициируют посев культуры при плотности посева от трех до 10 до пятой клетки на миллилитр в 125 миллилитров. Вибростенды работают при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 на орбитальной встряхивающей платформе. Вращаясь со скоростью вращения 125 об/мин, субкультивируйте клетки каждые три-четыре дня в полной питательной среде с плотностью посадки от двух до 10-10 пятых клеток на миллилитр для трансфекции клеток.

Поддерживайте температуру в клетках при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение 12-24 часов до трансфекции, чтобы убедиться, что клетки активно делятся. Затем, после получения плазмидной ДНК, подсчитывают клетки методом исключения требухи и синей матрицы и разбавляют клетки до рабочего объема 20 миллилитров среды для клеточных культур. В 125 миллилитрах встряхните колбу в концентрации один умножить на 10 до шестой клетки на миллилитр.

Используйте подходящий набор для трансфекции для используемой клеточной линии, включающий по крайней мере одну отрицательную контрольную лунку, содержащую клетки, но не содержащую ДНК. Инкубируйте трансфицированные клетки в течение четырех дней в статическом режиме. Теперь добавьте подходящий антибиотик для выбора плазмиды в концентрацию, подходящую по кривой уничтожения.

Например, в этом исследовании зин добавляли до конечной концентрации 400 граммов на миллилитр для отбора трансфицированных клеток, а затем переносили культуры на встряхивающую платформу, вращающуюся со скоростью 125 об/мин. Меняйте среду через соответствующий для клеточной линии интервал времени, добавляя антибиотик каждый раз до тех пор, пока клетки в контрольной лунке не погибнут. Используйте наиболее сливающиеся лунки для продвижения к встряхивающимся культурам.

Затем заморозьте клетки в криогенных флаконах, содержащих от 10 до 7 до 7 жизнеспособных клеток в одном миллилитре замораживающей смеси для создания кривых роста партии и подаваемой партии. Во-первых, устанавливают тройные клеточные культуры трансфицированных клеток СНО в колбах Shake объемом 250 миллилитров с рабочим объемом 50 миллилитров. Затем поместите культуры в увлажненный клеточный инкубатор с встряхиванием и извлекайте 4,1 миллилитр образцов из каждой растущей культуры с интервалом в 24 часа.

Скармливая контрольным культурам тот же объем чистой воды, используйте 100 микролитров из 4,1 миллилитров образцов из 4,2 в день для подсчета клеток путем трипа и исключения синей матрицы до тех пор, пока концентрация жизнеспособных клеток не снизится до нуля. Для определения коэффициента ладов Измерений центрифугируйте два миллилитра ежедневных образцов и повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах ледяного PBS, перенесите половину клеточной суспензии в шестилуночный планшет и добавьте пустой образец, не содержащий клеток, к одному. Что ж, затем немедленно измерьте уровни синей и желтой флуоресценции на длине волны возбуждения 430 с полосой пропускания 35 нанометров и длине волны миссии 465 с полосой пропускания 35 нанометров и 520 с шириной полосы 10 нанометров для синей и желтой флуоресценции соответственно.

Рассчитайте отношения ладов, определив отношение обнаруженной желтой флуоресценции к отношению синей флуоресценции. Теперь уменьшите последние два миллилитра ежедневных образцов, а затем дважды промойте гранулу в ледяной PBS после второй промывки. Ультразвуком обрабатывайте образец пять раз в течение трех минут каждый раз с импульсом 15 секунд включения и 15 секунд выключения.

Наконец, выполните анализ метаболитов в соответствии с инструкциями производителя и используйте полученные стандартные кривые для расчета внутриклеточного уровня глюкозы или глутамина в зависимости от ситуации. В этом репрезентативном эксперименте заросшие партии культуры двух клеточных линий поддерживались, как только что было продемонстрировано, с ежедневными образцами, используемыми для калибровки in vivo каждой фибры. Репрезентативный профиль роста жизнеспособных клеток двух клеточных линий по отношению к их внутриклеточным уровням глюкозы или глутамина продемонстрирован на этом графике, а соответствующие измерения ладов и внутриклеточные концентрации метаболитов, определенные с помощью ферментативных анализов, представлены в этой таблице.

Было установлено, что низкое количество клеток, присутствующее в первые четыре дня культивирования, привело к ненадежному сигналу лада. Аналогичным образом, высокий уровень клеточного лизата, присутствующий после восьмого дня культивирования, вызывал большое рассеяние света. Таким образом, для построения калибровочных кривых для глюкозы и глутамина используются только данные за день с четвертого по восьмой.

Результаты показывают, что сигнал FIB обеспечивает надежную корреляцию с внутриклеточными концентрациями от одного до пяти миллимоляров для глюкозы и 0,3 и двух миллимоляров для глутамина. Для подтверждения полученных результатов были проведены исследования с использованием заросших культур двух клеточных линий. Корм, содержащий высокую концентрацию субстрата, добавляли на шестой день культивирования клеток для повышения внеклеточных концентраций субстрата.

Как показывают трансплантаты, соотношения ладов в каждый день демонстрируют четкую реакцию на кормление. Развернув тренд, они продолжали двигаться вплоть до шестого дня. Например, в культурах, получавших глюкозу, внеклеточная концентрация глюкозы снова увеличилась до 36 миллимоляров.

В то время как в культурах, получавших глутамин, концентрация глутамина увеличивалась до четырех миллимоляров. В эксперименте с глюкозой отношение ладов для выбранной клеточной линии глюкозы уменьшалось на седьмой день в ответ на добавление глюкозы. Так как глюкоза fibs следует APO по конфигурации.

Аналогичным образом, в эксперименте с глутамином отношение ладов для выбранной клеточной линии с глутамином увеличивалось в ответ на добавление глютамина в соответствии с принципом выключения сенсоров APO. Эти измерения ладов были в конечном итоге использованы для расчета соответствующих внутриклеточных концентраций глюкозы и глутамина на основе вышеупомянутых калибровочных кривых. Они сравниваются с фактическими внутриклеточными концентрациями этих субстратов, определенными с помощью ферментативных анализов глюкозы и глютамина, и показывают адекватное соответствие после его развития.

Этот метод открывает путь для исследователей в области изучения влияния различных составов сред на продуктивность белка. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать генетически кодируемые биосенсоры для мониторинга внутриклеточных концентраций метаболитов.