ФИБС поддержкой неинвазивной метаболического профилирования

Общая цель данной процедуры заключается в неинвазивном мониторинге уровня внутриклеточной глюкозы или глутамина с использованием генетически кодируемых белковых биосенсоров. Это достигается путем первоначальной трансфекции интересующих клеток плазмидой, содержащей ген биосенсора, и последующего отбора клеток, экспрессирующих данный биосенсор. На втором этапе из культур периодического или периодического с подпиткой культивирования отбирают образцы клеточных культур и измеряют их значения FRET-отношения.

Внутриклеточную концентрацию глюкозы или глутамина в образцах затем можно определить с помощью независимого анализа. В конечном итоге отношение FRET в образцах может быть использовано для неинвазивного расчета внутриклеточной концентрации глюкозы или глутамина в режиме реального времени. Возможности этого метода способствуют совершенствованию биопроцессов, так как он представляет собой надежный способ получения метаболической информации в режиме реального времени, которая может быть использована для онлайн-оптимизации и контроля.

Хотя этот метод может быть использован для изучения биопроцессов, его также можно применять в других системах, включая детектирование маркеров заболеваний. Начните с восстановления клеток CHO в 9 мл полной ростовой среды. Затем центрифугируйте клетки, ресуспендируйте осадок в 10 мл свежей ростовой среды и подсчитайте количество клеток с помощью метода исключения трипанового синего красителя.

Затем инициируйте культивирование при плотности посева 3 × 10⁵ клеток/мл в колбах объемом 125 мл при 37 °C и 5% CO2 на орбитальном шейкере. При скорости вращения 125 RPM проводите субкультивирование клеток каждые три-четыре дня в полной ростовой среде при плотности посева 2 × 10⁵ клеток/мл для последующей трансфекции клеток.

Выдерживайте клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение 12–24 часов перед трансфекцией, чтобы убедиться в их активном делении. После подготовки плазмидной ДНК подсчитайте количество клеток методом исключения трипанового синего и разведите клетки в культуральной среде до рабочего объема 20 мл. Используйте колбу для встряхивания объемом 125 мл при концентрации 1 × 10⁶ клеток/мл.

Используйте подходящий набор для трансфекции для данной клеточной линии, включая как минимум одну лунку с отрицательным контролем, содержащую клетки, но без ДНК. Инкубируйте трансфецированные клетки в течение четырех дней в статическом режиме. Затем добавьте соответствующий антибиотик для селекции плазмид в подходящей концентрации, определенной с помощью кривой гибели.

Например, в данном исследовании для селекции трансфицированных клеток добавляли zin до конечной концентрации 400 grams per milliliter, после чего культуры переносили на встряхивающую платформу, вращающуюся со скоростью 125 RPM. Смену среды проводили с интервалом, соответствующим данной клеточной линии, каждый раз добавляя антибиотик до тех пор, пока клетки в контрольной лунке не погибали. Для перевода в условия встряхивания использовали лунки с наибольшей степенью конфлюэнтности.

Затем заморозьте клетки в криопробирках, содержащих 1 × 10⁷ жизнеспособных клеток в 1 mL замораживающей смеси, для последующего построения кривых роста при периодическом и фед-батч культивировании. Сначала создайте три параллельные культуры трансфицированных клеток CHO в колбах для встряхивания объемом 250 mL с рабочим объемом 50 mL. Затем поместите культуры в увлажненный клеточный инкубатор с встряхиванием и отбирайте пробы объемом 4,1 mL из каждой растущей культуры с интервалом в 24 часа. Для культур при фед-батч культивировании на шестой день добавьте клеткам соответствующее количество глюкозы или глутамина, чтобы восстановить их концентрации до исходльных значений.

Для кормления контрольных культур используйте тот же объем чистой воды; ежедневно берите по 100 µL из образцов объемом 4,1 мл, полученных в пункте 4.2, для подсчета клеток методом исключения трипанового синего до тех пор, пока концентрация жизнеспособных клеток не снизится до нуля. Для определения соотношения FRET центрифугируйте 2 мл ежедневных образцов и ресуспендируйте осадок в 2 мл ледяного PBS; перенесите половину клеточной суспензии в 6-луночный планшет, добавив в одну лунку холостой образец без клеток. Затем немедленно измерьте уровни синей и желтой флуоресценции при длине волны возбуждения 430 нм с шириной полосы 35 нм и длинах волн испускания 465 нм с шириной полосы 35 нм и 520 нм с шириной полосы 10 нм для синей и желтой флуоресценции соответственно.

Вычислите коэффициенты FRET, определив отношение интенсивности детектируемой желтой флуоресценции к интенсивности синей флуоресценции. Затем центрифугируйте последние два миллилитра ежедневных проб и дважды промойте осадок в ледяном PBS; после второй промывки подвергните образец соникации пять раз по три минуты с импульсным режимом: 15 секунд работы и 15 секунд перерыва.

Наконец, проведите анализы метаболитов в соответствии с инструкциями производителя и используйте полученные стандартные кривые для расчета внутриклеточных уровней глюкозы или глутамина, в зависимости от задачи. В данном репрезентативном эксперименте культуры двух клеточных линий выращивались партиями, как было показано ранее, при этом ежедневные пробы использовались для калибровки каждого датчика in vivo. Репрезентативный профиль роста жизнеспособных клеток двух линий в зависимости от их внутриклеточного содержания глюкозы или глутамина представлен на этом графике, а соответствующие измерения FRET и концентрации внутриклеточных метаболитов, определенные с помощью ферментативных анализов, приведены в этой таблице.

Было установлено, что малое количество клеток в первые четыре дня культивирования приводило к недостоверному сигналу FRET. Аналогичным образом, высокая концентрация клеточного лизата после восьмого дня культивирования вызывала значительное рассеяние света. Таким образом, для построения калибровочных кривых для глюкозных и глутаминовых FRET-сенсоров использовались данные только за период с четвертого по восьмой день.

Результаты показывают, что сигнал FIB достоверно коррелирует с внутриклеточными концентрациями глюкозы в диапазоне от 1 до 5 мМ и глутамина от 0,3 до 2 мМ. Для подтверждения данных FIB было проведено кормление переросших культур двух клеточных линий. На шестой день культивирования клеток добавлялась питательная смесь с высокой концентрацией субстрата для повышения его внеклеточной концентрации.

Как видно из графиков, показатели соотношения фретов в каждый из дней демонстрируют четкий ответ на подкормку. Начиная с шестого дня, тенденция сменилась на противоположную. Например, в культурах, получавших глюкозу, внеклеточная концентрация глюкозы снова возросла до 36 millimolar.

В то же время в культурах с подачей глутамина концентрация глутамина увеличилась до 4 mM. В эксперименте с глюкозой отношение FRET для клеточной линии glucose fibs снизилось на седьмой день в ответ на добавление глюкозы. Поскольку glucose fibs следует конфигурации APO-on.

Аналогично, в эксперименте с глутамином отношение FRET для клеточной линии с сенсором на глутамин увеличилось в ответ на добавление глутамина, что соответствует принципу работы сенсоров APO off. Эти измерения FRET были в конечном итоге использованы для расчета соответствующих внутриклеточных концентраций глюкозы и глутамина на основе вышеупомянутых калибровочных кривых. Полученные значения были compared с фактическими внутриклеточными концентрациями этих субстратов, определенными с помощью ферментативных методов анализа глюкозы и глутамина, и после разработки метода продемонстрировали удовлетворительную сходимость.

Этот метод открывает перед исследователями в данной области возможности для изучения влияния различных составов сред на продуктивность белков. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать генетически кодируемые биосенсоры для мониторинга внутриклеточных концентраций метаболитов.