DNBS / TNBS колит Модели: Предоставление взглянуть на воспалительное заболевание кишечника и эффекты диетического жира

Общая цель данной процедуры заключается в предложении альтернативного и недорогого метода изучения воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) с использованием DNBS (2,4-динитробензолсульфоновой кислоты). Это достигается путем первоначального внутриректального введения DNBS посредством осторожного введения в анальное отверстие. На втором этапе получают срезы тканей толстой кишки для гистологического скрининга и оценки миелопероксидазной активности в тканях, подвергшихся воздействию DNBS; в конечном итоге с помощью макроскопических и микроскопических методов можно оценить влияние пищевых масел на потерю веса и развитие колита.

Основным преимуществом данного подхода по сравнению с существующим методом с использованием декстрансульфата натрия является то, что метод с DNBS проще в исполнении, менее затратен и обладает высокой воспроизводимостью. Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области исследований ВЗК, такие как роль стресса и депрессии в рецидивировании ВЗК или фундаментальные механизмы повреждения и восстановления кишечника. Для ректального введения DNBS мышам начните с установки одномиллилитрового шприца на иглу 19 gauge. Затем, используя полиэтиленовый катетер 50, аспирируйте свежеприготовленный раствор DNBS в катетер.

Затем нанесите слезный гель мыши, находящейся под наркозом, и осторожно надавите кончиками пальцев на заднюю часть животного, чтобы удалить каловые массы из дистального отдела ободочной кишки. Теперь введите небольшое количество раствора DNBS для смазки ободочной кишки, чтобы облегчить введение, и осторожно введите катетер интраректально примерно на три-четыре сантиметра. После установки катетера введите 100 µL DNBS или равный объем 50% этанола для животных контрольной группы.

Затем удерживайте животное головой вниз в течение 90 секунд, чтобы предотвратить вытекание реагентов. После введения DNBS в течение первой недели давайте животным 8% раствор сахарозы в 0,2% физиологическом растворе для предотвращения обезвоживания. В течение всего эксперимента до достижения требуемой временной точки необходимо тщательно и ежедневно контролировать потерю веса, обезвоживание или признаки дистресса у животных.

После воздействия DNBS вскройте брюшную полость эвтаназированного животного и извлеките весь толстый кишечник. Затем разрежьте кишечник продольно. Макроскопические язвы слизистой оболочки должны наблюдаться примерно в двух-трех сантиметрах проксимальнее дистального конца ободочной кишки.

Отоберите фрагменты длиной 0,5 см проксимальнее места максимального макроскопического повреждения у подопытных животных, а также сегменты толстой кишки из соответствующих анатомических зон у животных контрольной группы. Затем подвергните мгновенной заморозке в жидком азоте фрагменты по 0,5 см от одного контрольного образца и одного образца, обработанного 1D NBS, для оценки активности миелопероксидазы, а остальные фрагменты зафиксируйте в 10% нейтральном буферном формалине на ночь для гистологического анализа. На следующее утро промойте фиксированные в формалине ткани 70% этанолом и поместите в кассету для отправки в гистологическую лабораторию с целью заливки в парафин и окрашивания гематоксилином и эозином для гистологической оценки.

Затем оцените под световым микроскопом не менее трех срезов тканей от каждого животного, чтобы определить степень гистологического повреждения для каждой группы. Для анализа активности миелопероксидазы в тканях, подвергнутых воздействию DNBS, сначала гомогенизируйте быстрозамороженные контрольные и экспериментальные образцы тканей в буфере для гомогенизации миелопероксидазы, чтобы получить суспензию из 50 mg сегмента толстой кишки на 1 mL буфера для гомогенизации. Затем разлейте гомогенизированный раствор порциями по 1 mL и центрифугируйте их в течение двух минут при 10,000 ×g и 4 °C.

Затем перенесите по 100 µL каждой аликвоты в отдельные кюветы, добавьте 2,9 mL PBS с добавлением IDE, дигидрохлорида и перекиси водорода, тщательно перемешивая. В завершение измерьте скорость поглощения с помощью спектрофотометра при 460 нм. После проведения интраректального введения DNBS, как было продемонстрировано выше.

Значительная потеря веса наблюдается к 48 часам у крыс, получавших добавки рыбьего или рапсового масла, и к 72 часам у крыс, получавших добавки сафлорового масла. Максимальная потеря веса зафиксирована через 48 часов у крыс, получавших рыбий жир, и через 72 часа у крыс, получавших добавки рапсового или сафлорового масла.

Прибавка в весе возобновилась через 72 часа, и к пятому дню после введения DNBS группы, получавшие рыбье и сафлоровое масла, продемонстрировали массу тела, близкую к исходным значениям. Контрольные крысы, получавшие диетические масла и подвергшиеся интраректальному введению этанола, стабильно набирали вес на протяжении всего пятидневного периода исследования. Повреждение кишечника, вызванное DNBS, может носить обширный характер.

Тем не менее, область максимального повреждения обычно локализуется в дистальных шести сантиметрах толстой кишки у крыс и в дистальных трех сантиметрах у мышей. При более детальном гистологическом анализе наблюдается обширное повреждение эпителия, включая образование язв, инфильтрацию нейтрофилами и лимфоцитами, истощение слизистого слоя и отек. Хотя эти гистологические признаки воспаления и повреждения тканей очевидны во всех трех группах, получавших добавки растительных масел, при воздействии DNBS, наиболее тяжелые повреждения наблюдаются в группе с сафлоровым маслом, за которой следует группа с рапсовым маслом.

В то время как у крыс в группе, получавшей рыбий жир, наблюдается минимальное повреждение эпителия и ограниченная инфильтрация воспалительных клеток в слизистую оболочку. Различия в степени гистологических повреждений между образцами могут быть количественно определены для более точного сравнения групп. На графике представлены показатели гистологических повреждений для трех групп с различными диетическими маслами при колите, индуцированном DNBS.

Как видно на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, в группе с добавлением сафлорового масла наблюдается наибольшая степень повреждения, за которой следует группа с рапсовым маслом. В то время как в группе с рыбьим маслом наблюдается наименьшая степень повреждения, степень инфильтрации воспалительными клетками, в частности нейтрофилами, может быть дополнительно изучена путем проведения анализа активности миелопероксидазы. Это соответствует ожидаемым результатам, основанным на гистологических показателях повреждения.

Оценка активности миелопероксидазы в толстой кишке крыс на пятый день после воздействия DNBS выявила повышение активности во всех трех группах; при этом наибольшая активность миелопероксидазы наблюдалась в группе, получавшей сафлоровое масло, за которой следовали группы, получавшие рапсовое и рыбье масла. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости легкой анестезии мышей и оптимизации доз DNBS после их разработки. Этот метод открыл исследователям в области воспалительных заболеваний кишечника возможность изучить механизмы, контролирующие воспаление кишечника на животных моделях ВЗК.

Не забывайте, что работа с DNBS может быть крайне опасной, поэтому при приготовлении раствора необходимо всегда использовать средства защиты, такие как защитная одежда, перчатки, очки и маски.