Супер-Resolution Imaging нейронных Плотные-ядерные пузырьков

Общая цель данной процедуры заключается в получении флуоресцентных изображений сверхвысокого разрешения, которые позволяют выяснить важные аспекты организации везикул с детализацией, недоступной при обычном использовании флуоресцентной микроскопии. Для этого сначала в нейроны гиппокампа вводят ДНК, кодирующую фотопереключаемые химеры груза везикул. На втором этапе с помощью системы микроскопии сверхвысокого разрешения собираются необработанные изображения с разреженным сэмплированием.

Далее необработанные изображения подвергаются обработке для получения изображения сверхвысокого разрешения. На заключительном этапе данные квантифицируют для выяснения организации везикул. В конечном итоге линейные профили интенсивности пунктирных структур можно использовать для сравнения расстояния между везикулами с их шириной, чтобы определить, расположены ли везикулы достаточно близко друг к другу для формирования кластера при использовании данной методики.

Одноцветная фотоактивируемая локализационная микроскопия или PALM может быть использована для изучения организации органелл в большинстве типов культивируемых клеток. Чтобы запустить систему получения изображений сверхвысокого разрешения, начните с включения питания дуговой лампы. Затем переключите выключатели системного ПК и компонентов на удаленном блоке питания.

Переключите тумблер в положение «on» после включения планшета управления микроскопом, включите компьютер и запустите программное обеспечение. Разверните окно статуса загрузки, чтобы убедиться в нормальной работе системы, и выберите опцию запуска системы в диалоговом окне входа. Чтобы установить образец для визуализации, откройте переднюю и верхнюю панели шкафа лазерной безопасности и наклоните рычаг проходящего света для доступа к предметному столику и объективам.

Затем нанесите иммерсионное масло на объектив alpha plan APO Chromat 100x с общим внутренним отражением, флуоресценцией или turf. Для начального этапа фокусировки выберите объектив с малым увеличением. Теперь установите образец на предметный столик и подведите объектив к образцу.

Контролируйте положение объектива с помощью функции X, Y, Z на управляющем планшете. Остановитесь, когда объектив окажется приблизительно в фокусе. Визуализируйте образец и выполните точную настройку фокуса.

Опустите осветительную штангу и полностью закройте панели доступа. Затем во вкладке «locate» нажмите на символ расширения окуляров. Чтобы вывести схему хода лучей, выберите «trans on» и убедитесь, что на схеме показан прошедший от лампы свет, падающий на образец. Посмотрите в окуляры и сфокусируйте изображение клеток, используя управляющий планшет в качестве руководства.

Затем, чтобы идентифицировать клетки, экспрессирующие DRA two, выберите отраженный свет и фильтр, подходящий для визуализации зеленого излучения от den two. Сканируйте покровное стекло, используя отраженный свет низкой интенсивности, пока не будет найдена жизнеспособная яркая клетка, после чего настройте программное обеспечение для сбора данных PALM. Перейдите на вкладку сбора данных (acquisition) и с помощью менеджера экспериментов загрузите соответствующую конфигурацию для сбора данных PALM.

Когда появится всплывающее меню с запросом о включении лазеров, нажмите «да», затем сфокусируйте изображение клетки в плоскости камеры. Выберите только канал 488. Настройте параметры сбора данных, такие как усиление E-M-C-C-D, после чего выберите непрерывный сбор данных.

Затем настройте яркость дисплея до нужного уровня и перемещайте объектив до тех пор, пока изображение на экране не станет четким. Чтобы получить обычное изображение в широком поле, нажмите кнопку snap и сохраните изображение. Для настройки освещения на базе Turf в канале 488 выберите Turf на кнопке epi turf.

Для оптимизации освещения по типу «turf» выберите режим непрерывного сбора данных (continuous acquisition) и регулируйте угол наклона осветителя «turf» до тех пор, пока фон внезапно не потемнеет, а образец не станет возможным сфокусировать в одной плоскости. Переключитесь на канал 561 нм, выключив лазер с длиной волны 405 нанометров. Установите усиление E-M-C-C-D примерно на 200, а время экспозиции — примерно на 50 миллисекунд.

Выберите эмиссионный фильтр, пропускающий красный свет, и установите интенсивность лазера примерно на 40%. Дважды проверьте угол поворота столика для дорожки 561. Чтобы уменьшить фоновый сигнал, освещайте образец до тех пор, пока фон не исчезнет. Используйте дорожку 561 только с активированным лазером 561.

Для сбора данных PALM включите лазер с длиной волны 405 нм для трека 561 и установите интенсивность 405-нм лазера примерно на 0,01%. Чтобы отслеживать вычисляемое изображение PALM во время сбора данных, разверните меню параметров онлайн-обработки и выберите пункт «online processing palm», чтобы запустить обработку с параметрами по умолчанию. Нажмите «start experiment», чтобы начать сбор данных; в процессе сбора визуально контролируйте фотоконверсию, увеличивая интенсивность фотоконвертирующего лазера с длиной волны 405 нм. Когда наступит насыщение, интенсивность фотоконверсии начнет снижаться.

Когда фотопреобразование перестает расти после увеличения интенсивности лазера, нажмите «завершить текущий этап» (finish current step). Для завершения эксперимента сохраните файл. Чтобы обработать сохраненные изображения, перейдите на вкладку обработки (processing tab), откройте меню методов (method menu) и раскройте подменю «ладонь» (palm sub menu).

Снова выберите palm из четырех доступных подвариантов. Выберите соответствующее изображение, чтобы оно отобразилось в окне просмотра. Разверните параметры метода и нажмите select для ввода изображения, затем разверните поле настроек и выберите default, чтобы выполнить поиск и локализацию пиков с параметрами по умолчанию.

Нажмите «apply» во вкладке обработки, чтобы рассчитать изображение PALM; оно появится в отдельной вкладке окна просмотра для фильтрации плохо репрезентированных компонентов данных. Используйте теорему Котельникова (Найквиста-Шеннона) и инструмент «remove palm outliers» для удаления пиков в областях, где среднее расстояние между пиками (строчная d) слишком велико, чтобы разрешить везикулу диаметром (заглавная D). При открытом изображении PALM в окне просмотра нажмите «select», чтобы ввести изображение, и нажмите «apply». Новое изображение появится в отдельной вкладке окна просмотра для фильтрации любых плохо локализованных флуоров.

Перейдите на вкладку фильтра PAL и ограничьте область допустимых данных. Установите точность локализации для сигмы менее 35 nanometers. Чтобы выбрать режим отображения изображения PAL, перейдите на вкладку рендеринга PAL, выберите разрешение пикселей и желаемый режим отображения.

На данном изображении красным цветом показан репрезентативный конечный результат PALM-визуализации и обработки изображения нейрональной плотной сердцевинной везикулы (DCV). Латеральные координаты локализованных флуоров в белом цвете отображены в режиме Centro, а изображение связанной везикулы со сверхвысоким разрешением представлено в режиме Гаусса. На втором рисунке показаны аналогичные изображения сомы и проксимальных отростков гиппокампального нейрона (8 дней in vitro), экспрессирующего tpa-danger2, в режиме широкопольной микроскопии (зеленый цвет) и PALM (красный цвет).

Важными особенностями изображений являются обширное взаимно однозначное соответствие и перекрытие в желтом цвете между пунктами на обычных изображениях и изображениях, полученных с помощью palm. Значительно меньший размер palm-пунктов и периодическое разрешение одного широкопольного пункта на несколько palm-пунктов. Здесь представлено palm-изображение D cvs вдоль части одного отростка второго нейрона гиппокампа, экспрессирующего tpa.

Представлено изображение DENDRA two. Обратите внимание на малый диаметр и однородный вид пунктиров, а также на редкое наблюдение тесно расположенных друг к другу пунктиров, которые представляют собой предполагаемые кластеры DCV. На этом заключительном рисунке описан простой количественный метод определения того, находятся ли две или более cv достаточно близко, чтобы образовывать кластер.

Профили линий интенсивности пунктат генерируются, как показано на графиках, и в дальнейшем могут быть использованы для количественной оценки расстояния между плотными ядрами везикул (DCV) и их ширины. Если расстояние значительно превышает ширину, DCV не контактируют друг с другом. В то время как если расстояние примерно равно ширине, согласно этим критериям, DCV могут контактировать; везикулы на этом изображении были классифицированы как не контактирующие, тогда как везикулы на этом изображении были классифицированы как контактирующие при применении данной процедуры.

Для изучения относительной локализации различных структур могут быть использованы другие методы, такие как двухцветная PALM.