Использование газовой хроматографии для анализа изменения состава жирных кислот в ткани печени крыс во время беременности

Общая цель этой процедуры заключается в анализе жирнокислотного состава печени. Это достигается путем предварительного взвешивания образца печени и его гомогенизации. Второй шаг заключается в извлечении всех липидов из гомогенизированного образца печени.

Затем отдельные классы липидов, такие как сложные эфиры холестерина, разделяются с помощью твердофазной экстракции. Заключительным этапом является ификация и деривация классов липидов в метиловые эфиры жирных кислот. В конечном счете, газовая хроматография используется для того, чтобы показать, как жирнокислотный состав тканей может измениться после диетологического вмешательства или под влиянием изменений физиологического состояния, таких как беременность.

Хотя этот метод может дать представление о составе жирных кислот в тканях, он также может быть применен к другим типам образцов, таким как масло, семена и пищевые продукты. Как правило, пользователи, плохо знакомые с этой техникой, могут испытывать трудности, поскольку некоторые части протокола требуют ловкости рук и практики, например, повторяющийся сбор верхних и нижних фаз. Демонстрировать процедуру будут Хена, Фиск и Аннет Уэст, техник и аспирант нашей лаборатории.

Сначала отрежьте примерно 100 миллиграммов замороженной печени и взвесьте ткань. Поместите салфетку в пластиковую трубку в ведро со льдом и добавьте 0,5 миллилитра ледяного льда, 0,9% хлорида натрия. Затем гомогенизируйте ткань и переложите в стеклянную трубку с завинчивающейся крышкой.

Используйте еще 0,3 миллилитра 0,9% хлорида натрия, чтобы перенести остатки ткани в стеклянную трубку с завинчивающейся крышкой. После этого добавьте в пробирку 100 мкг холестерина хета дечен стандарта, растворенного в соотношении два к одному, сухой хлороформ к метанолу, а затем дополнительно пять миллилитров того же растворителя, содержащего 50 мг на литр бутилированного гидрокситолуола. После добавления одного миллилитра одного моляра хлорида натрия закройте пробирку крышкой и тщательно перемешайте образец, перемешивая до тех пор, пока он не станет однородным.

Затем центрифугируют образец при 1000-кратном G в течение 10 минут с низким перерывом при комнатной температуре. Когда закончите, соберите нижнюю фазу с помощью стакана мимо пипетки и переложите ее в новую стеклянную трубку с завинчивающейся крышкой. Затем просушите образец под азотом при температуре 40 градусов Цельсия.

На этом этапе подключите бак SPE к вакуумному насосу и поместите картридж SPE с аминопропилкремнеземом на бак. Поместите новую стеклянную трубку с завинчивающейся крышкой с маркировкой TAG и CCE в бак-стеллаж под колонной, чтобы собрать первую фракцию. Растворите общий липидный экстракт в одном миллилитре сухого хлороформа и перемешайте образец путем вортексирования.

После этого перенесите образец в колонку с помощью стеклянной пасты-пипетки и дайте жидкости капнуть в пробирку с завинчивающейся крышкой под действием силы тяжести. Когда жидкость перестанет капать из колонки, удалите остатки жидкости с помощью вакуума. Далее элюируют фракцию ТАГ и СЕ, дважды промыв колонку одним миллилитром сухого хлороформа под вакуумом.

Когда вся жидкость выйдет из колонны, высушите фракцию TAG и CE в азоте при температуре 40 градусов Цельсия. Поместите новый картридж с аминопропилкремнеземом SPE на бак SPE и поместите стеклянную трубку с завинчивающейся крышкой в лоток бака под картриджем для сбора отходов. Трижды под вакуумом промойте колонку одним миллилитром сухого гексана.

После выключения пылесоса промойте колонку последним одним миллилитром гексана H. под действием силы тяжести. После замены отработанной пробирки на новую завинчивающуюся крышку стеклянной трубки с маркировкой CE, растворите высушенные фракции TAG и CE в одном миллилитре сухого гексана и перемешайте образец методом вортексирования. Затем перенесите образец в колонку с помощью стеклянного прохода или пипетки и дайте жидкости капнуть через колонку под действием силы тяжести.

Когда жидкость перестанет капать из колонки, удалите оставшуюся жидкость под вакуумом под вакуумом. Дважды промойте колонку одним миллилитром сухого гексана для элюирования КЭ и высушите собранную фракцию под азотом при 40 градусах Цельсия. После этого добавьте 0,5 миллилитра сухого толуола к отделенной фракции КЭ и перемешайте образец методом вортексирования.

Добавьте к растворенному в сухом толуоле образцу один миллилитр приготовленного ранее реагента для метилирования. Затем надежно закройте пробирку и перемешайте Осторожно нагрейте образец в течение двух часов до 50 градусов Цельсия. Как только образцы остынут до комнатной температуры, добавьте один миллилитр нейтрализующего раствора.

Затем добавьте в образец один из сухих гексанов После вихревой центрифугирования центрифугируйте образцы при 250-кратном перегрузке в течение двух минут с низким разрывом при комнатной температуре. Когда закончите, соберите верхнюю фазу славы и перенесите ее в новую одноразовую стеклянную трубку без завинчивающейся крышки. Высушите собранный образец славы под азотом при температуре 40 градусов Цельсия.

После помещения в бак SPE пробирки для отходов и силикагеля, картриджа SPE на бак, трижды промыть колонку одним миллилитром сухого гексана под вакуумом и одним миллилитром сухого гексана под действием силы тяжести. После удаления отходов смывает. Добавьте в бак новую пробирку для отходов, затем растворите образец CE fame в одном миллилитре сухого гексана.

После перемешивания образца методом вортекса перенесите его в колонку с помощью стеклянного прохода или пипетки. После того, как жидкость просочилась через колонку под действием силы тяжести, трижды промойте колонку одним миллилитром гексана под вакуумом. Затем удалите смывки для отходов и поместите в бак новую трубку с винтовой крышкой с маркировкой CE fame.

Разбавьте фракцию CE fame двумя 1 миллилитрами от 95 до пяти сухих гексанов до d-этилового эфира. Затем высушите собранную фракцию под азотом при температуре 40 градусов Цельсия, растворите высушенную фракцию в 75 микролитрах сухого гексана и перемешайте образец методом вортексирования после того, как образец был перемешан методом вортексирования. Перенесите его во флакон с автоматическим образцом GC после повторения предыдущего шага.

Проанализируйте образец на газовом хроматографе, если протокол выполнен успешно. Хроматограмма с четкими симметричными, четко выраженными пиками и с минимальным фоновым шумом должна быть получена, как показано здесь. Если произошло загрязнение, хроматограмма покажет дополнительные пики и покажет несимметричные или асимметричные пики, как показано здесь.

Загрязнение свободным холестерином произойдет при беге FAME, полученного из CE, если холестерин не будет удален. Использование подготовленной калибровочной смеси позволяет идентифицировать известность в образце. Калибровочная смесь запускается с использованием тех же настроек прибора, что и образцы, чтобы можно было сравнить хроматограмму с образцом и пиками, идентифицированными на основе времени их удержания, как показано здесь.

Нулевой пик 16 выделен здесь для иллюстрации сравнения времени удержания от калибровочной смеси на верхней хроматограмме до жирных кислот. В нижней пробе трассировки, позволяющей правильно маркировать пиковую площадь жирных кислот, используется для расчета процентного соотношения конкретных жирных кислот в общем количестве. После того, как данные собраны, полезно проверить их на наличие выбросов, как показано здесь.

Затем можно дополнительно исследовать образцы выбросов, а при необходимости повторить экстракцию и/или анализ. Как показано здесь, известность КЭ печени крыс описывается как процент от общего количества жирных кислот в КЭ печени. Эти данные описывают содержание жирных кислот CE в печени девственных или беременных крыс, которых кормили в течение 20 дней на одной из трех различных диет.

Статистический анализ с использованием двухфакторной Innova выявляет значимое влияние диеты и беременности на соотношение нескольких жирных кислот, а также значимое влияние диеты на взаимодействие беременности. Например, содержание КЭ в печени беременных крыс в большей степени зависит от диеты, чем у девственных самок. Этот метод позволяет выполнять 20 образцов в день от начала до конца, если он выполнен правильно.

После освоения пакетов образцов можно увеличить производительность и удвоить объем обрабатываемых образцов за неделю. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как анализировать жирнокислотный состав отдельных классов липидов с помощью твердофазной экстракции и газовой хроматографии. Не забывайте, что работа с растворителями может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в вытяжных шкафах и ношение подходящих СИЗ.