Масштабируемость Высокая пропускная Выбор фага-дисплее синтетических библиотек антител

Общая цель этой масштабируемой процедуры заключается в выделении специфических и высокоаффинных клонов фагов Fab из отображаемой фаговой библиотеки с использованием высокопроизводительного подхода, который обеспечивает параллельный отбор по сотням антигенных целевых доменов. Это достигается путем первичной иммобилизации очищенных антигенных доменов в микролуночных планшетах. Следующие шаги заключаются в экспонировании, захвате, высвобождении и амплификации клонов фагов, которые специфически связываются с иммобилизованным антигеном микропланшетов в последовательных раундах отбора.

Во время этого процесса эффективность отбора контролируется с помощью объединенных методов на каждом этапе. Последним шагом является оценка специфичности, аффинности и/или активности изолированных клонов фабрики. В конечном счете, специфические высокоаффинные fab-фрагменты против большого числа антигенов выделяются параллельно, что позволяет генерировать антитела, полезные для анализа целых классов структурно или функционально связанных белков.

Важность этого метода заключается в том, что он предлагает альтернативу, которая может помочь преодолеть ограничения и ускорить темпы разработки традиционных технологий антител как в академической, так и в промышленной лаборатории. Основное преимущество этого метода по сравнению с традиционными методами разработки антител, такими как гибридома, заключается в том, что он не требует использования животных. Его можно использовать практически для любого белка, включая токсичные и неиммуногенные белки.

Как мы увидим, он легко распараллеливается и в конечном итоге дает возобновляемую рекомбинантную ДНК, кодирующую высокоаффинное антитело, специфичное для конкретного антигена, а также функциональные и стандартные иммунологические анализы всего за шесть-восемь недель. Учитывая важность антител в исследованиях в области биомедицины, мы увидели возможность адаптировать и масштабировать генерацию антигенов, а также отбор и идентификацию антител к высокопроизводительному подходу, сохраняя при этом доступность лабораторий как по размеру, так и по имеющимся ресурсам. Утром в день выбора фага выберите одну колонию Т-однофаговых устойчивых клеток кишечной палочки.

Добавьте его в миллилитр двух yt сред с тетрациклином в концентрации 50 микрограмм на миллилитр. Дайте колонии инкубироваться, встряхивая при 200 оборотах в минуту в 2,5-сантиметровом орбитальном шейкере. Как только рост культуры станет визуально заметен, перенесите клетки в необходимый объем среды с добавлением тетрациклина.

Его должно хватить на 100 микролитров на одну выбранную лунку, или примерно 10 миллилитров на 96 миллилитров. Хорошо расширьте аликвоты культуры как до углеродного пенициллина, так и до среды, дополненной канином. Эти культуры защищают от предварительного инфицирования клеток, используемых для амплификации.

Когда оптическое поглощение культуры достигает от 0,4 до 0,8 на 595 нанометрах. Через пять-семь часов клетки готовы к нанесению на антигенные пластины. Для этого протокола для обеспечения желаемого охвата библиотеки необходимо подготовить достаточное количество реплицированных антигенных пластин и неспецифических контрольных белковых пластин.

С помощью отображаемых расчетов детали предоставляются в текстовом протоколе. После ночной иммобилизации целевых и неспецифических контрольных белков удалить белковый раствор из планшета. Добавьте 200 микролитров блокирующего буфера и блокируйте в течение одного часа встряхиванием и промойте планшет четыре раза перед добавлением библиотеки фагов во время роста клеток.

В день отбора фагов мы предварительно очищаем неспецифические или специфичные для связывания фаговые клоны FAB, отображаемые из библиотеки, перенося 100 микролитров библиотеки фагов на планшеты негативной селекции для добавления негативного выбора. Удалите фаг, связывающий метку, добавив избыток растворимой аффинной метки. Для этого добавьте в каждый из них конечную концентрацию растворимого GST в 10 микромоляров.

Ну а затем инкубируйте тарелки в течение одного-двух часов в шейкере при комнатной температуре. Чтобы приготовить раствор аспирата белка целевой белковой пластины из пластины, добавьте 200 микролитров блокирующего буфера и заблокируйте на один час встряхиванием и промывкой четыре раза перед добавлением библиотеки фагов. После инкубации соберите фаговую нацию с планшетов.

С помощью 96-канального обработчика жидкости перенесите супинат фага на пластины, покрытые антигеном. Затем выдержите тарелки в течение одного-двух часов в шейкере при комнатной температуре. После инкубации удалите несвязанный фаг, промыв лунки от восьми до 15 раз с использованием буфера PT.

Это можно сделать вручную или с помощью автоматической мойки пластин. Затем, непосредственно перед добавлением клеток, удалите все излишки буфера для промывки, когда клетки и антигенные пластины будут готовы. Разбавьте фаг, добавив по 100 микролитров растущих клеток в каждую лунку, и дайте планшетам инкубироваться при температуре 37 градусов Цельсия в течение получаса.

Ожидается, что первые несколько раундов отбора не приведут к значительному обогащению, но количественная оценка титров выходных фагов может обеспечить иллюзию минимальных концентраций фагов, необходимых для успешного отбора. Для этого аликвота клеток может быть удалена до добавления хелперного фага, чтобы уменьшить выход фага путем приготовления и нанесения серийных разведений клеток на агаровые пластины, дополненные антибиотиками. После инкубации в течение получаса добавьте в каждую лунку M 13 K oh seven helper phage до концентрации 10 миллиардов колониеобразующих единиц на миллилитр.

Дайте планшетам инкубироваться еще 45 минут, на этот раз с встряхиванием при 200 оборотах в минуту. Затем переведите ячейки в блок лунок глубиной 96 лунок с V-образным дном, содержащий 1,2 миллилитра дополненных двух сред YT на лунку. Дайте глубоколуночным планшетам инкубироваться при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи с встряхиванием при 200 оборотах в минуту на следующий день.

Измельчите бактерии, вращая пластины при температуре 4000 GS в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Затем с каждой репликационной пластины переносите равные объемы надосадочной жидкости, содержащей фаг, в мини-пробирку. 96 лунок микропланшета синего прямоугольника использовать в качестве входных данных для последующих раундов отбора в объединенный фаг, добавить один 10-й объем 10 XPBT и перемешать для нейтрализации.

Теперь повторите процесс выбора из библиотеки. Предварительный клиренс и фаговая инкубация антигена три-четыре раза с использованием фага, амплифицированного из предыдущего раунда отбора. Делайте это до тех пор, пока не будет наблюдаться целевое обогащение связывания по сравнению со связыванием неспецифических контрольных белков с помощью микролуночных планшетов Eliza, кодированных двумя микрограммами на миллилитр антигена или контрольного белка, как описано ранее в библиотеке, предварительно клиренс и инкубация антигенных фагов блокируют и промывают, как и раньше, на заблокированные и промываемые антигенные и контрольные пластины, покрытые белком, вносят 100 микролитров разбавленного фагового супа в лунки и дают планшетам инкубироваться с встряхиванием в течение 15 минут при комнатной температуре После инкубации вымойте планшеты восемь раз с помощью буфера PT.

Затем, после промывки, добавьте 100 микролитров антитела против M 13 HRP в дозе от 1 до 5000 люций в PBT в каждую лунку, инкубируйте в течение получаса, чтобы антитела могли связываться с антиген-связанным фагом. Затем шесть раз промыть пластины буфером PT и еще два раза прямым PBS приготовить, смешать и нанести по 100 микролитров субстрата один к одному TMB на каждую из лунок. Дайте этому отреагировать в течение пяти-15 минут, останавливая реакцию, когда произойдет значительное изменение цвета.

Остановите реакции, добавив 100 микролитров одного моляра фосфорной кислоты. Теперь считайте поглощение в лунках на 450 нанометрах и сравните целевые сигналы связывания с сигналами связывания контрольных белков после обогащения. Отдельные клоны могут быть выделены и охарактеризованы с помощью секвенирования фага, ДНК-конверсии фага, связанного со свободным фабрикой, и оценки прямого связывания с мишенью с использованием клонального FabuLisa, как описано в текстовой части протокола.

Для лабораторий, в которых требуется более высокая производительность, эту методологию можно масштабировать и автоматизировать. С этой целью была разработана индивидуальная робототехника, которая может расширить возможности выбора за счет автоматизации всех аспектов процедуры, включая блокировку, фаг, связывание, элуциан и многое другое. Одним из подходов к получению антигена для использования в селекции антител является использование технологий синтетических генов для получения конструкций для экспрессии изолированных белковых доменов.

В большинстве случаев это позволяет обеспечить высокую пропускную экспрессию и выделение достаточных количеств достаточно чистого очищенного антигена для селекции. В течение последующих раундов процесса отбора ускользающие концентрации фагов и обогащение фагов, которые специфически связываются с антигеном, контролировались либо с помощью титрования фагов, как показано ранее, либо с помощью пулов фагов. В анализе ELA отношение связывания больше двух обычно указывает на наличие специфических связывающих клонов.

И наоборот, более низкое соотношение может помочь определить причину неудачного выбора. Определение характеристик связывания клонов с помощью колорметрического аминоанализа позволяет сравнивать связывание фага fab или fab с иммобилизованным антигеном по сравнению с связыванием отрицательного контрольного белка, что позволяет получить меру специфичности при масштабировании и автоматизации отбора с помощью роботизированных устройств для работы с жидкостями. Использование поглощающих хромофоров может помочь обнаружить, когда определенные каналы в жидкости либо забиты, либо потеряли свою герметичность, что приводит к частичной объемной доставке, а также помочь в устранении неполадок во время оптимизации процедур промывки, использование известных клонов связывания гарантирует, что целевое связывание сохраняется, в то время как фоновое связывание удаляется во время промывки.

Кроме того, эффективные протоколы обеззараживания обеспечивают отсутствие перекрестного загрязнения в результате последовательных раундов отбора или различных процедур отбора, а также рекомендуются дополнительные параметры устранения неполадок, которые рассматриваются в текстовом протоколе. Масштабируя этот метод для промышленного применения, мы надеемся дать возможность исследователям исследовать целые классы структурно или функционально связанных белков за счет ускорения отбора и идентификации высокоаффинных возобновляемых антител с конечной целью достижения максимального покрытия протеома.