Характеристика многослойных рыбьей чешуи (

Общая цель данной процедуры заключается в определении структуры, химического состава и механических свойств многослойных минерализованных чешуек рыб с помощью рентгеновской компьютерной томографии, наноиндентирования, ИК-фурье-спектроскопии и сканирующей электронной микроскопии в сочетании с энергодисперсионной рентгеновской спектроскопией. Это достигается путем предварительной подготовки отдельных чешуек к анализу: удаления мягких тканей, монтажа и секционирования чешуек с последующей пошаговой полировкой. На втором этапе проводится пространственно коррелированное наноиндентирование по поперечному сечению чешуйки с использованием алмазного наконечника Перковича для определения локальных наномеханических свойств.

Затем внутренний и внешний слои чешуи рыбы исследуются с помощью ИК-фурье микроскопа для идентификации основных функциональных групп в соответствующих слоях. На заключительном этапе используется детектор EDX сканирующего электронного микроскопа для сопоставления локального химического состава с наноотпечатками, сделанными на чешуе рыбы, а также для получения изображений отпечатков в различных слоях и на поверхностях разлома. В конечном итоге, путем сочетания этих различных экспериментальных методов, выясняются естественные принципы построения минерализованной чешуи рыб через понимание взаимосвязи между структурой и свойствами.

Основное преимущество данного метода по сравнению с другими существующими способами тестирования, такими как статистическое наноиндентирование объектов, заключается в том, что он обеспечивает прямую корреляцию между структурой химического состава и локальными механическими свойствами. В областях нашего интереса мы применяли этот метод для изучения пространственного распределения, структуры химического состава и механических свойств структурных биоматериалов. Он также находит множество применений, включая цементные материалы, многофазные композиты и любые типы гетерогенных материалов, проявляющих неоднородность на микро- и наноразмерном уровнях.

Чтобы исследовать поперечный срез короткой оси чешуи рыбы, зафиксируйте чешую в форме для образцов диаметром 32 millimeter, используя имеющийся в продаже пластиковый держатель для образцов, чтобы обеспечить правильную ориентацию образца при заливке эпоксидной смолой. После того как образец будет закреплен в форме, залейте его неотвержденной эпоксидной смолой. После отверждения смолы в соответствии с инструкциями производителя выполните срез закрепленного образца по его срединной линии с помощью высокоточной отрезной пилы с алмазным диском.

После загрузки образца в наноиндентомер используйте элементы управления программного обеспечения, чтобы переместить образец в точку первого отпечатка; выполните четыре параллельных ряда отпечатков с интервалом 15 мкм, начиная с этой точки, для получения статистически значимого набора данных. Затем установите для наноиндентора максимальную нагрузку 5 мН, скорость нагружения и разгружения 0,1 мН/с, общее время 30 с и минимальный интервал между отпечатками в каждом ряду 5 мкм. После завершения серии с помощью наноиндентора создайте реперные отпечатки с максимальной нагрузкой 100 мН в позициях первого и последнего отпечатков, которые должны располагаться в эпоксидной смоле соответственно перед слоем наноструктуры и после слоя кости.

После наноиндентации поместите образец обратно в раствор PBS, чтобы избежать дальнейшего обезвоживания. Жестко закрепите образец таким образом, чтобы его наибольшее измерение было параллельно детектору. После настройки сканера зафиксируйте закрепленный образец на предметном столике сканера, используя рентгенопрозрачные материалы, такие как пенопласт и параформ.

Разместите образец таким образом, чтобы он находился в центре вращения. На протяжении всего сканирования выбирайте максимально возможное разрешение, при котором весь масштаб будет виден в поле зрения, что в данном случае составляет 7.5 micrometers. После сбора данных реконструируйте рентгеновские проекционные изображения для создания набора данных, содержащего изображения поперечных срезов.

Затем с помощью программного обеспечения получите итоговое 3D-изображение в градациях серого. Отрегулируйте диапазон градаций серого до соответствующего уровня, чтобы удалить артефакты от пенополистирола и параформа. Для получения изображений наноиндентов на полированном образце с помощью СЭМ (сканирующей электронной микроскопии) закрепите образец на держателе для СЭМ, используя двустороннюю углеродную ленту, так, чтобы поверхность с индентами была обращена вверх. Затем поместите образец в камеру СЭМ и откачайте воздух в камере до достижения режима низкого вакуума.

Установите рабочее расстояние в диапазоне от 3.0 до 5.0 мм. Подайте высокое напряжение и перейдите к интересующим областям образца, которыми в данном случае являются структуры, присутствующие в слоях аноэ и кости. Затем получите изображения при высоком напряжении от 5 kV до 15 kV и пониженном токе пучка 3.9 nA.

Для повышения разрешения получите изображения как минимум из трех областей интереса при увеличении от 250 x до 10 000 x, используя детектор обратнорассеянных электронов BSE в режиме низкого вакуума, чтобы облегчить идентификацию изменений в плотности и содержании биоминералов. После этого перейдите к области интереса на полированном образце, которая содержит сетку наноиндентирования, обозначенную реперными метками в конце каждой линии отпечатков. Убедитесь, что высокое напряжение составляет не менее 15 kilovolts.

Ток пучка составляет не менее 3,9 nA, а рабочее расстояние превышает 5,0 mm. Затем получите изображение области, предназначенной для EDX-анализа, в режиме обратно-рассеянных электронов. Используйте программное обеспечение для EDX-анализа.

Сделайте такое же изображение, чтобы облегчить поиск областей для проведения химического анализа вдоль линии отпечатков. Затем, используя метод линейного анализа, расположите линию для химического анализа вдоль интересующей линии отпечатков, начиная от первого отпечатка и заканчивая последним. Укажите количество точек анализа вдоль линии, равное количеству имеющихся отпечатков, чтобы обеспечить прямую пространственную корреляцию между химическим составом и механическими свойствами.

После позиционирования линии и корректного указания точек запустите линейный анализ с помощью программного обеспечения EDX. По завершении анализа определите элементы, подлежащие количественному анализу, на основе точечных спектров, полученных вдоль заданной линии на полированной поверхности образца.

После идентификации интересующих элементов проведите калибровку фона, чтобы учесть тормозное излучение легких и другие эффекты. Выберите в программном обеспечении опцию деконволюционного анализа для получения количественных данных по каждой точке вдоль заданной линии с целью определения химического состава в каждой из этих точек. В завершение сохраните результаты количественного химического анализа вместе с изображением проанализированной линии для облегчения пространственной корреляции с механическими свойствами, измеренными с помощью наноиндентирования в слое anoe; при наноиндентировании были рассчитаны средний модуль упругости 69.0 GPa и твердость 3.3 GPa.

Методом наноиндентирования для костного слоя было определено среднее значение модуля упругости 14.3 giga pascals и твердости 0.5 giga pascals. Слой anoe и костный слой характеризуются количественными различиями в химическом составе. Пик углерода в костном слое может быть обусловлен низкой степенью минерализации, что приводит к увеличению содержания углерода и снижению яркости изображения BSE. ИК-фурье-спектры костного слоя и слоев ENE демонстрируют признаки гидроксиапатита во внешнем слое gwe и признаки коллагена во внутреннем костном слое.

Рентгеновская компьютерная томография показывает, что слой gwe не покрывает костный слой в местах перекрытия чешуй. Более светлые серые слои gwe являются более плотными, твердыми и жесткими, в то время как более темные серые костные слои менее плотны и менее жесткие. Наблюдаются отчетливые углубления рядом с центром слоя ging, что свидетельствует о его неоднородности.

СЭМ-изображение поверхности травленого излома при малом увеличении выявило наноструктуры, организованные в слоистую структуру для слоя гингивы, что коррелирует с данными ИК-фурье-спектроскопии; СЭМ-изображения поверхности травленого излома при большем увеличении демонстрируют ориентированные наностержни в слое гингивы, в то время как в костном слое после его развития наблюдается волокнистая наноструктура. Данный метод открыл путь для дополнительных исследований биоматериалов и композитных материалов с целью изучения пространственного распределения химического состава, структуры и механических свойств, а также анализа границ раздела фаз в многофазных композитных материалах. Итак, после просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать образцы и проводить анализ для пространственной корреляции химического состава со структурой и механическими свойствами структурных биоматериалов.

Эти методы также применимы и могут быть адаптированы для изучения других типов гетерогенных многофазных материалов.