Характеристика кальцификации событий с использованием живого оптической и электронной микроскопии методы в морской Tubeworm

Общая цель этой процедуры заключается в определении локализации и структуры события кальциноза путем выполнения комбинации методов оптической и электронной микроскопии. Это достигается путем наблюдения за живыми личиночными трубчатыми червями во время метаморфоза, жизненной стадии, ответственной за кальцификацию, которую можно обнаружить с помощью флуоресцентных индикаторов, чувствительных к внутриклеточным сигналам pH и кальция. Внутриклеточная рН-томография позволяет изучать концентрацию протонов в цитоплазме и из нее в процессе кальциноза.

Для начала проведения внутриклеточной визуализации pH у личинок морского трубчатого червя, компетентных плавающих личинок окрашивают внутриклеточным индикаторным красителем SNARF-1 AM. Затем личинки переносятся в чашку с IBMX, содержащую морскую воду с тонким стеклянным наблюдательным окном, и помещаются на флуоресцентный микроскоп, где на них попадает свет с длиной волны 488 нанометров, который поглощается красителем. От красителя улавливаются излучения 580 нм и 640 нм. Значения внутриклеточного pH могут быть рассчитаны из соотношений этих значений.

Оптическая микроскопия позволяет нам определить время и область ткани, связанные с более высоким уровнем pH. Это первый шаг к определению временных точек интереса для дальнейшего анализа. На втором этапе законсервируйте трубчатого червя с помощью фиксаторов в соответствующие моменты времени для электронной микроскопии.

Новая стадия минерализации определяется с помощью картирования SEM-EDS для сигнала кальция. Затем области с высоким уровнем кальциевого сигнала экранируются с помощью SEM/EBSD, определяя присутствие кристаллического минерала. Наконец, с помощью сфокусированного ионного пучка минерал вырезают, подготавливают тонкий разрез для наблюдения ПЭМ.

Этот разрез используется для получения селективной диаграммы дифракции в области. Основное преимущество этого метода или обычных методов испытаний, таких как объемная рентгеновская дифракционная спектроскопия, заключается в том, что он обеспечивает прямое наблюдение специфических структур, которые были обнаружены методами оптической и электронной микроскопии, следовательно, дискретные события кальцификации могут быть изучены непосредственно как на временном, так и на пространственном уровнях. Когда кальцификацию изучают с помощью кальция и внутриклеточных показателей pH, мы можем определить временную шкалу этих соответствующих физиологических событий.

Сохранение образца в нужное время имеет решающее значение для успешного анализа СЭМ. При поиске первого случая биологической кальцификации SEM/EDX может быть использован для скрининга элементного распределения кальция. Место, где больше кальция, может указывать на присутствие карбоната кальция, однако только наличие рентгеновской дифракционной картины может подтвердить наличие кристаллической структуры.

Такую информацию можно получить с помощью ЭБСД и ПЭМ. Дифракция обратного рассеяния электронов — это метод кристаллографической характеризации для идентификации кристаллического или поликристаллического материала, при условии, что микроструктура и угол РЗМ электронов удовлетворяют брэгговскому дифракционному условию. Как правило, обратно рассеянные электроны собираются под углом наклона 70 градусов на полированном образце с картами ориентации зерен или кристаллов.

Для неотшлифованного образца построить такую карту из этих неровных поверхностей сложно, потому что не все сервисные серии удовлетворяют требованиям угла EBSD. Тем не менее, в виде точки IG дифракционная картина Какуччи все еще может быть собрана из этих неровных поверхностей до тех пор, пока удовлетворяется требование угла EBSD. Дифракционная картина Какуччи дает однозначное подтверждение присутствия кристаллического минерала.

Наш метод является прямым и быстрым, и может быть применен к другим минерализующим тканям. В этом случае сфокусированный ионный пучок используется для изготовления микрообразца, что также является очень прямым методом подготовки сечения ПЭМ. Чтобы изучить процесс метаморфоза, трубчатые черви культивировались в лаборатории в течение примерно пяти дней.

Грамотные личинки будут плавать в прямом направлении, а не круговыми движениями. Это значит, что они готовы к метаморфозам. Инкубируйте компетентных личинок в флуоресцентном растворе в морской воде, накройте емкости фольгой для предотвращения фотообесцвечивания и инкубируйте животных на ночь.

Личинки трубчатых червей промываются о нейлоновую сетку, которая удерживает личинок, но пропускает раствор. Промойте личинок отфильтрованной морской водой два раза, чтобы удалить излишки раствора красителя. Прижмите сетчатый фильтр к чашке Петри, чтобы создать плотное уплотнение, прежде чем отпустить уплотнение, чтобы сбросить моющий раствор.

Следите за тем, чтобы личинки не пересохли. Затем поместите каждую из 10-20 личинок в тонкую чашку со стеклянным дном с IBMX и накройте чашку крышкой до момента визуализации. Затем вставьте подходящие фильтрующие кубики с соответствующими дихроичными зеркалами для обнаружения флуоресцентных сигналов.

Оптимизируйте время затвора, чтобы оно было достаточно быстрым для получения изображений для живого организма. Затем выберите параметры оптического среза на опции Z-Stack, переместите микроскопический столик вверх и вниз, чтобы определить начальную и конечную позицию получения изображения. Установите расстояние между слоями в один микрометр.

После создания образа экспортируйте все данные в виде файлов TIF в оттенках серого. Это можно выполнить, выбрав «Файл», «Экспорт». Убедитесь, что типы файлов отображаются как изображения TIF, затем нажмите «Начать».

Изображение в оттенках серого в каждом канале, в каждом слое Z-Stack будет находиться в той же папке изображений, готовое к анализу изображений. Наконец, сгенерируйте составное изображение для каждого из флуоресцентных каналов с помощью ImageJ. В следующих видеороликах JoVE показано, как выполнять калибровку и измерения внутриклеточного pH.

Законсервируйте трубчатых червей, претерпевающих метаморфоз, с помощью сшивающего фиксатора, используя раствор 4% параформальдегида в морской воде. Просто смешайте одну часть 16% параформальдегида с тремя частями морской воды и дайте закрепиться в течение ночи. Утилизируйте первичный фиксатор и повторно зафиксируйте образец на 30 минут в водном растворе 1% тетраоксида осмия для дальнейшей стабилизации тканевых структур.

Обязательно работайте в вытяжном шкафу и располагайте отдельные бутылки для отходов, которые имеют четкую маркировку, готовят формальдегиды и тетраоксид осмия. Затем обезвоживайте образцы с помощью градуированного ряда этанола, оставляя пять минут между заменами. Следующим шагом является обезвоживание образцов раствором этанола и HMDS в соотношении 1:1, достаточным для покрытия образца.

Подождите, пока образец высохнет в вытяжном шкафу, затем повторите процедуру с чистыми HMDS. Чтобы создать контролируемый излом образца, проведите алмазным диском по чашке, окружив несколько особей, чтобы сделать треугольный разрез. Накрыв чашку Петри, поместите чашку для культуры на алюминиевый стержень, осторожно надавите, чтобы сделать контролируемый перелом.

Понаблюдайте с помощью диссекционного микроскопа, осторожно подберите фрагмент перелома, который содержит несколько неповрежденных трубчатых червей. Серебряной краской наклейте образец на держатель образца SEM, закрасьте края серебряной краской для уменьшения заряда. Теперь образец готов к получению изображений для анализа SEM-EDS.

Вставьте образец в держателе в микроскоп. Сориентируйте образец и поместите его под колонку электронов. Проанализируйте образец в режиме VP SEM.

Оптимизируйте фокусировку и астигматизм по мере необходимости. Выберите увеличение таким образом, чтобы один организм занимал все поле зрения. Проанализируйте распределение кальция по элементам в образце, получив карту всего поля зрения, проведите карту в течение 15 минут или дольше или до тех пор, пока данные не покажут четкую локализацию кальция в организме.

Чтобы получить количественную оценку точки для области интереса, выберите опцию Идентификатор точки с помощью инструмента Одна точка. Нажмите на интересующую область, чтобы выполнить сканирование. Тщательно запишите местоположение, сделав серию снимков с уменьшающимся увеличением.

Для подготовки образцов к ЭБСД извлеките образец из плоского держателя СЭМ и приклейте его к предварительно наклоненному под углом 45 градусов птенцу с помощью серебристой краски. Используя референсные снимки СЭМ, можно определить местонахождение интересующего животного и точную область обитания исследуемого животного. Наклоните предметный столик на 25 градусов так, чтобы поверхность образца оказалась примерно на 70 градусов к электронному пучку.

Поднимите сцену. Выберите режим EBSD в программном обеспечении AZtec. В качестве интересующих фаз выберите арагонит.

Вставьте камеру EBSD, установите условия камеры для достижения сигнала около 90%Используя растр быстрого луча, получите фон, затем сделайте снимок в ацтекском режиме. С помощью инструмента «Точечный анализ» нажмите на местоположение образца, в котором показан более высокий сигнал кальция. Просканируйте, обнаружены ли узоры Какуччи.

Если шаблоны присутствуют и соответствуют какой-либо из выбранных фаз в базе данных, они будут автоматически проиндексированы. Подготовленный образец СЭМ защитить слоем платины с помощью напыления перед тем, как приступить к подготовке микрообразца с использованием сфокусированного ионного пучка. Вставьте образец в камеру FIB SEM, расположите образец и получите живое изображение вторичных электронов, индуцированное ионами.

Найдите область интереса на ссылочных изображениях, как это было ранее определено картографированием EDS в EBSD. Поворачивайте сцену по мере необходимости, чтобы интересующие объекты совпадали с рамкой окна, регулируйте увеличение, чтобы показать область, чтобы вместить интересующие объекты, затем определите рамку для нанесения углерода и вольфрама. Сделайте снимок FIB, затем нарисуйте узор из четырех прямоугольников вокруг вольфрамового колпачка, чтобы определить место микровыборки.

Затем наклоните предметный столик под углом 58 градусов и прорежьте дно микрообразца. Наклоните столик обратно в нулевое положение, вставьте вольфрамовый зонд для микросэмплинга, затем опустите его, пока он не соприкоснется с образцом. Соедините вольфрамовый зонд и образец, поместив вольфрам между наконечником зонда и вольфрамовым покрытием, затем сделайте окончательный разрез, отсоедините микрообразец от остальной части острова и поднимите зонд с прикрепленным микрообразцом.

Поместите медную полурешетку ПЭМ в держатель бокового входа, опустите вольфрамовый щуп до тех пор, пока микрообразец не соприкоснется с сеткой ПЭМ. Микрообразец подвергается дальнейшему фрезерованию до тех пор, пока он не станет электронно-прозрачным. Перед анализом ПЭМ заполните оба дьюара жидким азотом и установите ускоряющее напряжение на 300 киловольт.

Поместите полусетку с прикрепленными ламелями в стандартный держатель ПЭМ. Центрируйте луч на люминофорном экране, сжимайте и расширяйте луч и следите за тем, чтобы все движения луча были концентрическими. Используйте ручки движения предметной области для навигации и определения местоположения образца, увеличения увеличения образца и регулировки Z-Height, пока образец не окажется в фокусе.

При необходимости используйте оптические окуляры. Вставьте камеру и снимите люминофорный экран. При необходимости расширяйте луч, чтобы избежать перенасыщения камеры.

Отрегулируйте фокус и параметры камеры для захвата изображения. Чтобы получить дифракционную картину, центрируйте интересующий объект, снимите апертуру объектива и вставьте дифракционную апертуру. Перейдите в режим дифракционной линзы.

Вставьте бланкер так, чтобы центр дифракционной картины не сгорел на камере или люминофорном экране. Захват изображения паттерна для кристаллографического анализа. Ниже приведены некоторые наблюдения за процессом кальцификации во время метаморфоза трубчатого червя.

Значения рН трубчатых червей увеличивались после стимуляции метаморфоза IBMX, а внутриклеточный рН начинал превышать восемь через 31 час. Тканью, имеющей отношение к кальцинозу, является воротниковая область. Карта сигналов SEM-EDS показывает, что в первый день у трубчатого червя наблюдалось однородное распределение кальция, что указывает на то, что процесс кальцификации еще не начался.

Через два дня после стимуляции метаморфоза некоторые трубчатые черви уже слишком сильно кальцинировались и уже не пригодны для наблюдения за вновь окаменевшими материалами. В образце трубчатого червя, подобном тому, который использовался в этом примере, кальцификация все еще находится на ранней стадии, поэтому количественное определение кальция помогло определить местоположение, представляющее интерес для характеристики присутствия минералов. При исследовании с помощью SEM-EBSD локализованная область с сильным кальциевым сигналом также имела кристаллическую структуру арагонита.

С помощью сфокусированного ионного пучка образец был подготовлен для ПЭМ и с большей кристаллографической детализацией проанализирована дифракционная картина из минерала арагонита. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как локализовать событие минерализации в многоклеточном организме. Когда оптическая и электронная микроскопия используются вместе, мы можем получить большой уровень физиологического и материального понимания процесса кальцификации.