В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки

Общая цель этой процедуры — визуализировать одиночные транскрипты РНК в живых клетках в режиме реального времени. Это достигается путем первой гибридизации двух олигонуклеотидов, которые были разработаны для формирования зонда, образующего шпильку, известного как метрика отношения по молекулярному маяку. Вторым шагом является очистка метрики отношения с помощью молекулярных маяков с помощью эксклюзионной хроматографии.

Затем метрика отношения с помощью молекулярных маяков вводится в клетки, экспрессирующие сконструированную РНК-мишень через микропорион. Заключительным этапом является попадание клеток в микролуночный планшет, подходящий для микроскопии живых клеток. В конечном счете, флуоресцентная микроскопия используется для мониторинга движений отдельных транскриптов РНК, визуализированных в виде ярких флуоресцентных пятен внутри отдельных клеток.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что в нем используются синтетические зонды, которые являются яркими фотостабильными и демонстрируют высокий сигнал к фону, что открывает возможность визуализации любой эндогенной РНК. Начните подготовку метрики отношения с помощью молекулярных маяков или RBM BS путем смешивания следующих реагентов в пробирке. 20 микролитров Rbm B один 30 микролитров Rbm B два шесть микролитров 10 x фосфатного буфера, и четыре микролитра свободной воды из ДНК и РНК. Обычно этого достаточно примерно для 50 исследований.

Выдержать смесь при комнатной температуре в течение 30 минут. Тем временем подготовьте колонку жидкостной хроматографии для удаления любых гибридизованных УН RBM B двух олигонуклеотидов. Используйте 75 супердек подготовительного класса в колонке жидкостной хроматографии объемом восемь миллилитров с объемом слоя около четырех миллилитров, используя шприцевой насос, работающий со скоростью потока 0,6 миллилитров в минуту.

Промойте и уравновесьте SUEx примерно 50 миллилитрами одного фосфатного буфера, прежде чем вся жидкость попадет в объем слоя. Остановите шприцевой насос, отсоедините его и дайте оставшейся жидкости пройти через колонку под действием силы тяжести. Далее загрузите смесь RBMB в хроматографическую колонку.

как образец RBMB полностью войдет в слой, медленно добавьте еще 250 микролитров одного x фосфатного буфера в верхнюю часть слоя, чтобы убедиться, что весь образец полностью вошел в колонку. Заполните столбец до края одним х фосфатным буфером. Закройте верхнюю часть и запустите шприцевую помпу.

Шприц наполнен примерно 50 миллилитрами одного XPBS и работает со скоростью потока 0,6 миллилитра в минуту. Как правило, образец RBMB можно легко визуализировать благодаря цвету красителя, включенного в зонд. Как только RBMB приблизится к нижней части колонны, соберите поток по две капли на каждую микроцентрифужную пробирку.

Прекратите сбор образца. Как только цвет образца в микроцентрифужных пробирках станет ясным, объедините пробирки, содержащие цветной образец RBMB, обычно пять-шесть пробирок, и загрузите их в центробежное фильтрующее устройство. Центрифугируйте образец при 10 000 RCF в течение 20 минут или до желаемого объема.

Такая скорость и время обычно дают конечный объем около 30 микролитров. В этом протоколе клеточная линия фибросаркомы человека была сконструирована для экспрессии Q-F-P-R-N-A с 96 тандемными повторами последовательности-мишени RBMB в трех основных UTR, контрольная клеточная линия была сконструирована для экспрессии дикого типа Q-F-P-R-N-A за день до клеток зондовой пластины доставки в колбе T 25 при культуре беглости от 40 до 50%. Клетки с DMEM-средой с добавлением 1% пен-стрептококка и 10% фетальной бычьей сыворотки инкубируют при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом на следующий день.

Включите микропору и настройте параметры микропортации, оптимизированные для ячеек HT 10 80. Заполните микропорионную пробирку четырьмя миллилитрами электролитического буфера и поместите ее на станцию микроподготовки. Разморозьте стоковый образец очищенного RBMB и разбавьте несколько микролитров до конечной концентрации 12 микромоляров с одним х фосфатным буфером.

На каждую микропорцию нужен один микролитр. Для каждой микропорционной реакции пипеткой вносите один миллилитр питательной среды с FBS, но без антибиотиков в микроцентрифужную пробирку. Отставьте его в сторону возле устройства микропориона.

Он будет использоваться в дальнейшем для суспензии клеток сразу после микроподготовки. Антибиотики не используются, потому что они снижают жизнеспособность клеток после микропрепаратов. Спроектированные элементы HT 10 80, покрытые накануне, теперь должны быть на 60–80% слитыми.

Удалите питательную среду для клеток и промойте клетки один раз одним миллилитром DPBS без кальция и магния, инкубируйте с одним миллилитром трипсина в течение одной-двух минут. Остановите выработку трипсина, добавив один миллилитр среды DMEM, дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой без антибиотиков и феноловым красным, и перенесите клетки в две микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Вращайте клетки в микроцентрифужной пробирке при 200-кратном G в течение пяти минут.

Удалите надосадочную жидкость, ресуспендируйте и соедините клеточные гранулы в конечном объеме один миллилитр DPBS. Удалите 10 микролитров из хорошо перемешанной клеточной суспензии, чтобы подсчитать клетки, пипетируйте клетки вверх и вниз несколько раз, чтобы убедиться, что они хорошо диспергированы, и перенесите 300 000 клеток с DPBS в новую микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитров. Вращайте вниз со скоростью 200 G в течение пяти минут.

Удалите надосадочную жидкость, стараясь не потревожить клеточную гранулу. Повторно суспендируйте гранулу в 11 микролитрах суспензии Resus, буфере и пипетке вверх и вниз несколько раз, чтобы убедиться, что клетки хорошо диспергированы. Следите за тем, чтобы не образовывались пузырьки воздуха.

Добавьте один микролитр разведенного RBMB и хорошо перемешайте, несколько раз пипетируя вверх и вниз. Опять же, будьте осторожны, чтобы не образовались пузырьки воздуха. Очень важно избегать попадания пузырьков воздуха в приостановку продаж RBMB, потому что пузырьки воздуха вызовут искру во время микроработы и приведут к плохой доставке RBMB и гибели клеток.

С помощью пипетки микропрепарата отаскайте 10 микролитров клеточной смеси RBMB и вставьте пипетку в пробирку микропрепарата. Нажмите кнопку запуска, чтобы запустить микрокорпорацию. В наконечнике не должно быть видимых пузырьков воздуха, когда сито микропоры показывает завершение.

Извлеките пипетку из станции и вытолкните смесь объемом 10 микролитров в заранее подготовленную микроцентрифугу, содержащую один миллилитр питательной среды с FBS, но без антибиотиков, аккуратно перемешанных, покачивая пробирку из стороны в сторону несколько раз. Вращайте ячейки со скоростью, умноженной на 200 G, в течение пяти минут. Дважды промойте клетки в одном миллилитре фенольной красной свободной питательной среды FBS, но без антибиотиков, чтобы удалить любые rbm BS, которые не были доставлены в клетки.

После второй стирки. Резус суспендирует клетки в 400 микролитрах феноловой красной свободной питательной среды с FBS, но без антибиотиков. Поместите микропропорциональные клетки в предварительно подготовленное покрытое поли-де-лизином восьмикамерное покровное стекло с концентрацией 200 микролитров на лунку или при желаемой равномерной концентрации.

Поместите камерное покровное стекло в инкубатор для клеточных культур. Визуализация может быть выполнена уже через 30 минут после микроподготовки. Чтобы начать эту процедуру, включите верхнюю инкубационную систему стадии живых клеток и уравновесьте ее до тех пор, пока она не достигнет 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа и 75% влажности.

Включите микроскоп и источник флуоресцентного света и откройте программу получения изображений метаморфа. Нанесите иммерсальное масло на цель. Перенесите камерное покровное стекло с микропористыми клетками на стадию живых клеток.

Топовая инкубационная система. Инкубируйте верхнюю систему ступени до стабилизации температуры и уровня углекислого газа. Откройте вкладку «Приобретение» в программе метаморфа.

Нажмите кнопку «Показать в реальном времени», чтобы найти поле. Отрегулируйте фокусировку при белом свете и нажмите кнопку «Остановить прямой эфир». На вкладке приобретение.

Нажмите и откройте всплывающую кнопку для захвата потока и настройте желаемые параметры приобретения фильма. Получение 150 кадров с помощью фильтра SCI five CF six 40 R. Сохраните изображения на жесткий диск.

Здесь представлены репрезентативные изображения клеток HT 10 80, стабильно экспрессирующих РНК с 96 тандемными повторами или четырьмя тандемными повторами сайта связывания RBMB в трех основных UTR. После внутриклеточной доставки mbs. Наличие 96 тандемных повторов позволяет отдельным транскриптам РНК проявляться в виде ярких флуоресцентных пятен.

Напротив, РНК, содержащая только четыре тандемных повтора, проявляется в виде очень тусклых флуоресцентных пятен и часто обнаруживается только в областях с исключительно низким фоном. Получение потоковых изображений позволяет визуализировать отдельные транскрипты РНК в режиме реального времени. Отдельные транскрипты РНК можно легко увидеть в цитоплазме и ядре клеток, претерпевающих броуновские или субдиффузионные движения.

В редких случаях РНК подвергается направленному транспорту, как показано здесь. Транскрипты РНК, подвергающиеся направленному транспорту, обычно быстро движутся по прямой траектории. В этом монтаже траектория транскрипта РНК показана наложенной на один кадр временного ряда.

Направленные движения РНК согласуются с транспортом РНК по микротрубочкам и микрофиламентам. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как готовить и очищать расовую метрику с помощью молекулярных маяков. Доставляйте расовую метрику с помощью молекулярных маяков в клетки с помощью микропариона и визуализируйте одиночные РНК-транскрипты с помощью флуоресцентного микроскопа.