В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки

Общая цель данной процедуры заключается в визуализации отдельных транскриптов РНК в живых клетках в режиме реального времени. Это достигается путем первоначальной гибридизации двух олигонуклеотидов, разработанных для формирования шпилечного зонда, известного как рациометрический молекулярный маяк. Вторым этапом является очистка рациометрических молекулярных маяков с помощью эксклюзионной хроматографии.

Затем с помощью микропорции в клетки, экспрессирующие модифицированную РНК-мишень, вводят метрики соотношения на основе молекулярных маяков. Заключительным этапом является посев клеток в планшет с микролунками, подходящий для микроскопии живых клеток. В конечном итоге используется флуоресцентная микроскопия для мониторинга перемещения отдельных транскриптов РНК, которые визуализируются в виде ярких флуоресцентных точек внутри одиночных клеток.

Основным преимуществом данного метода является использование синтетических зондов, которые обладают высокой яркостью, фотостабильностью и высоким отношением сигнал/фон, что открывает возможность визуализации любой эндогенной РНК. Начните приготовление рациометрических молекулярных маяков или RbmB, смешав в пробирке следующие реагенты: 20 µL RbmB 1, 30 µL RbmB 2, 6 µL 10x фосфатного буфера и 4 µL воды, свободной от ДНК и РНК. Этого объема обычно достаточно примерно для 50 исследований.

Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 30 минут. Тем временем подготовьте колонку для жидкостной хроматографии для удаления негибридизованных олигонуклеотидов RBM B two. Используйте 75 prep grade super decks в колонке для жидкостной хроматографии объемом восемь миллилитров с объемом слоя сорбента около четырех миллилитров, используя шприцевой насос при скорости потока 0,6 мл/мин.

Промойте и уравновесьте SUEx примерно 50 миллилитрами одного x фосфатного буфера до тех пор, пока вся жидкость не пройдет через объем слоя сорбента. Остановите шприцевой насос, отсоедините его и дайте оставшейся жидкости пройти через колонку под действием силы тяжести. Затем нанесите смесь RBMB на хроматографическую колонку.

После того как образец RBMB полностью entered в слой сорбента, медленно добавьте еще 250 µL 1x фосфатного буфера сверху, чтобы убедиться, что весь образец полностью entered в колонку. Заполните колонку 1x фосфатным буфером до края. Закройте верхнюю часть и запустите шприцевой насос.

Шприц заполняют примерно 50 миллилитрами 1×PBS и запускают при скорости потока 0,6 мл/мин. Как правило, образец RBMB легко визуализируется благодаря цвету красителя, встроенного в зонд. Когда RBMB приблизится к нижней части колонки, соберите элюат, помещая по две капли в каждую микроцентрифужную пробирку.

Прекратите сбор образца. Как только окраска образца в микроцентрифужных пробирках станет прозрачной, объедините содержимое пробирок с окрашенным образцом RBMB (обычно пять или шесть пробирок) и перенесите в центрифужный фильтр. Центрифугируйте образец при 10 000 RCF в течение 20 минут или до достижения необходимого объема.

При таких значениях скорости и времени конечный объем обычно составит около 30 µL. В данном протоколе была создана линия клеток фибросаркомы человека, экспрессирующая Q-F-P-R-N-A с 96 тандемными повторами целевой последовательности RBMB в 3'-UTR; контрольная линия клеток была создана для экспрессии Q-F-P-R-N-A дикого типа. За один день до доставки зонда клетки в T 25 флаконе высеивали при конфлюэнтности культуры 40–50%. Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 1% pen strep и 10% эмбриональной бычьей сыворотки, инкубируя при 37 °C с 5% CO2 до следующего дня.

Включите микропор и настройте параметры микропорации, оптимизированные для клеток HT 10 80. Наполните трубку для микропорации четырьмя миллилитрами электролитического буфера и установите ее на станцию для микропрепарации. Разморозьте стоковый образец очищенного RBMB и разведите несколько микролитров до конечной концентрации 12 micromolar с помощью 1x фосфатного буфера.

Для каждой микропорции требуется один микролитр. Для проведения реакции в микропорции перенесите пипеткой 1 мл культуральной среды с FBS, но без антибиотиков, в микроцентрифужную пробирку. Поместите её рядом с устройством для микропорционирования.

Это потребуется позже для суспендирования клеток сразу после микропрепарирования. Антибиотики не используются, так как они снижают жизнеспособность клеток после микропрепарирования. Модифицированные клетки HT 10 80, высеянные накануне, к этому моменту должны достичь 60–80% конфлюэнтности.

Удалите среду для культивирования клеток и один раз промойте клетки одним миллилитром DPBS без кальция и магния, затем инкубируйте с одним миллилитром трипсина в течение одного-двух минут. Остановите действие трипсина, добавив один миллилитр среды DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки без антибиотиков и фенолового красного, и перенесите клетки в две микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра. Осадите клетки в микроцентрифужной пробирке при 200 ×g в течение пяти минут.

Удалите супернатант, ресуспендируйте и объедините осадки клеток в конечном объеме 1 мл DPBS. Возьмите 10 мкл из хорошо перемешанной клеточной суспензии для подсчета клеток, несколько раз пропипетируйте клетки вверх и вниз, чтобы убедиться в их равномерном распределении, и перенесите 300 000 клеток с DPBS в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Центрифугируйте при 200 ×g в течение пяти минут.

Удалите супернатант, стараясь не задеть осадок клеток. Ресуспендируйте осадок в 11 µL буфера Resus suspension, несколько раз пропипетируя суспензию вверх и вниз для обеспечения равномерного распределения клеток. Следите за тем, чтобы не образовалось пузырьков воздуха.

Добавьте 1 µL разведенного RBMB и тщательно перемешайте, несколько раз прокачав раствор через наконечник пипетки. Снова будьте осторожны, чтобы не образовалось пузырьков воздуха. Критически важно не допустить попадания пузырьков воздуха в суспензию RBMB, так как они вызовут искрение во время микроманипуляций, что приведет к плохой доставке RBMB и гибели клеток.

С помощью микропипетки для подготовки проб наберите 10 µL смеси клеток RBMB и вставьте пипетку в микроцентрифужную пробирку. Нажмите кнопку запуска для начала микроинкорпорации. После того как на экране микропортора отобразится завершение процесса, в наконечнике не должно быть видимых пузырьков воздуха.

Извлеките пипетку из станции и внесите 10 µL смеси в предварительно подготовленную микроцентрифужную пробирку, содержащую 1 mL культуральной среды с FBS, но без антибиотиков; осторожно перемешайте содержимое, несколько раз покачав пробирку из стороны в сторону. Центрифугируйте клетки при 200 ×g в течение пяти минут. Дважды промойте клетки в 1 mL культуральной среды без фенолового красного с FBS, но без антибиотиков, чтобы удалить rbm BS, которые не проникли в клетки.

После второй промывки ресуспендируйте клетки в 400 µL культуральной среды с FBS, но без фенолового красного и антибиотиков. Рассейте клетки в предварительно подготовленное восьмилуночное камерное покровное стекло, покрытое поли-D-лизином, из расчета 200 µL на лунку или до достижения желаемой степени конфлюэнтности.

Поместите камерное покровное стекло в инкубатор для культур клеток. Визуализацию можно проводить уже через 30 минут после микропрепарирования. Чтобы начать эту процедуру, включите систему инкубации верхней части предметного столика для живых клеток и дождитесь стабилизации параметров: 37 °C, 5% carbon dioxide и 75% humidity.

Включите микроскоп и источник флуоресцентного света, затем запустите программное обеспечение для захвата изображений Metamorph. Нанесите иммерсионное масло на объектив. Перенесите покровное стекло с камерой, содержащей микропористые клетки, на предметный столик для живых клеток.

Верхняя система инкубации. Инкубируйте систему верхней части предметного столика до стабилизации температуры и уровней углекислого газа. Откройте вкладку «Acquire» в программном обеспечении Metamorph.

Нажмите кнопку «show live», чтобы найти нужное поле. Отрегулируйте фокусировку при белом свете и нажмите кнопку «stop live». Перейдите на вкладку «acquire».

Нажмите и откройте всплывающее окно захвата потока и установите желаемые параметры записи видео. Запишите 150 кадров, используя фильтр SCI five CF six 40 R. Сохраните изображения на жесткий диск.

Здесь представлены репрезентативные изображения клеток HT 10 80, стабильно экспрессирующих РНК с 96 тандемными повторами или четырьмя тандемными повторами сайта связывания RBMB в 3'-нетранслируемой области (3' UTR) после внутриклеточной доставки mbs. Наличие 96 тандемных повторов позволяет отдельным транскриптам РНК выглядеть как яркие флуоресцентные точки.

Напротив, РНК, содержащие всего четыре тандемных повтора, выглядят как очень тусклые флуоресцентные точки и зачастую обнаруживаются только в областях с исключительно низким уровнем фона. Получение потоковых изображений позволяет визуализировать отдельные транскрипты РНК в режиме реального времени. Отдельные транскрипты РНК легко видны в цитоплазме и ядре клеток, где они совершают броуновские или субдиффузионные перемещения.

В редких случаях может наблюдаться РНК, подвергающаяся направленному транспорту, как показано здесь. Транскрипты РНК при направленном транспорте обычно быстро перемещаются по прямой траектории. На этом монтаже траектория транскрипта РНК наложена на один кадр временной серии.

Направленные перемещения РНК согласуются с транспортом РНК вдоль микротрубочек и микрофиламентов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать и очищать молекулярные маячки для детекции РНК, вводить их в клетки с помощью микроинъекций и визуализировать отдельные транскрипты РНК с помощью флуоресцентного микроскопа.