Номера хроматографической очистки рекомбинантного Эластин-подобных полипептидов и их слияний с пептидов и белков с Кишечная палочка

Общая цель этой процедуры заключается в очистке рекомбинантных эластиноподобных полипептидов из кишечной палочки путем обратного переходного цикла. Это достигается путем сбора лизата из клеток кишечной палочки, которые экспрессируют рекомбинантный эластин, подобный полипептиду, и удаления нерастворимого клеточного мусора путем центрифугирования. Второй шаг заключается в удалении растворимых загрязняющих веществ путем индуцирования эластиноподобного полипептидного перехода с добавлением соли или нагрева.

Затем собирают эластин в виде полипептидного покрытия центрифугированием и отбрасывают надосадочную жидкость. Этот шаг называется горячим вращением. Затем ресуспендированный эластиноподобный полипептидный раствор центрифугируется для удаления нерастворимых загрязнений.

Растворимый эластин, подобный полипептиду в надосадочной жидкости, сохраняется, а гранула выбрасывается. Этот этап называется холодным отжмом, повторяя циклы горячего и холодного отжима до тех пор, пока не будет достигнута удовлетворительная чистота эластина, подобного полипептиду. В конечном счете, обратный цикл перехода дает чистые эластиноподобные полипептидные продукты, которые можно охарактеризовать для использования в различных биомедицинских приложениях.

Эластин-подобные полипептиды, очищенные с помощью этого метода, имеют ряд полезных применений, включая биосенсорику, тканевую инженерию и доставку лекарств, где температура перехода и биополимерная архитектура эластина-подобного полипептида могут быть специально настроены для каждого применения. Для начала экспрессируйте желаемую плазмиду, кодирующую ELP, в кишечной палочке, используя условия, описанные в сопроводительном текстовом протоколе. После встряхивания однолитровой культуры в инкубаторе в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия переложите культуру в литровую центрифугу, а затем центрифугируйте флакон при 2000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

Далее откажитесь от надосадочной жидкости и ресуса. Суспензируйте гранулу в воде PBS или другом желаемом буфере до общего объема 45 миллилитров. Затем переносимую клеточную суспензию в коническую трубку объемом 50 миллилитров

Поместите клеточную суспензию на лед и после остывания сосните в общей сложности на девять минут циклами по 10 секунд включения и 20 секунд выключения. С выходной мощностью 85 Вт. Дайте образцу остыть на льду в течение примерно 10 минут после первого раунда ультразвуковой обработки, а затем повторите девятиминутный цикл ультразвуковой обработки.

Переложите лизат в пробирку центрифуги с круглым дном объемом 50 миллилитров. Затем добавьте два миллилитра полиэтилена по 10% веса на объем на каждый литр культуры, и встряхните пробирку, чтобы перемешать, затем центрифугируйте пробирку при 16 000 GS в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем переложите надосадочную жидкость в чистую 50-миллилитровую центрифужную пробирку с круглым дном и выбросьте гранулу.

Добавьте в образец кристаллический хлорид натрия, чтобы вызвать переход ELP. Как только соль растворится, раствор станет мутным, что указывает на фазовое отделение ELP от раствора. Затем гранулируйте ELP, центрифугируя образец при давлении 16 000 GS в течение 10 минут.

При комнатной температуре гранула ELP может сначала показаться непрозрачной, выбросьте надосадочную жидкость, а затем добавьте от одного до пяти миллилитров нужного буфера после охлаждения. Гранулы ELP могут казаться полупрозрачными и коричневого цвета. Резус суспензирует гранулу путем пипетирования или вращения трубки на четыре градуса Цельсия.

Далее пипеткой внесите одну миллилитровую аликвоту ресуспендированного раствора ELP в чистые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Центрифугируйте пробирки при 16 000 GS в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем переложите надосадочную жидкость в чистую пробирку и выбросьте гранулы.

Индуцируют переход ELP с добавлением хлорида натрия. Если ELP имеет высокую температуру перехода, которую нельзя индуцировать только солью, инкубируйте образец на тепловом блоке в течение 15 минут при температуре, превышающей температуру перехода ELP. Затем центрифугируйте образец при давлении 16 000 GS в течение 10 минут при температуре выше температуры, используемой для этапа перехода ELP.

Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу ELP в дозе от 500 до 750 микролитров желаемого буфера с помощью пипетирования или вращения трубки при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока гранула не станет повторно растворимой. Затем центрифугируйте образец при давлении 16 000 GS в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить любые нерастворимые загрязняющие вещества. Затем переложите шарик в чистую пробирку и выбросьте гранулу Повторяйте обратный цикл перехода, пока не исчезнет загрязняющая гранула.

Обычно для этого требуется от двух до пяти циклов. Приготовьте серию разбавлений растворов ELP в PBS или другом желаемом буфере. Затем используйте УФ-спектрофотометр с контролируемой температурой для измерения оптической плотности на 350 нанометрах в диапазоне температур при нагревании образца со скоростью один градус Цельсия в минуту.

Если не наблюдается увеличения оптической плотности, то температура перехода может превысить верхний температурный предел. Затем измерьте уменьшение оптической плотности в том же диапазоне температур при скорости охлаждения один градус Цельсия в минуту. Чтобы проверить обратимость графика перехода ELP, оптическую плотность в зависимости от температуры, затем определите температуру перехода гомополимера ELP.

Определив точку перегиба в этом профиле мутности, успешная очистка LP подтверждается страницей SDS, как можно увидеть здесь. Количество загрязняющих веществ в исходном кишечном колилизате значительно больше по сравнению с образцом после одного раунда обратного цикла перехода. Температура перехода ELP характеризуется запрограммированной температурой мутности для гомополимера ELP.

Профиль мутности демонстрирует однократное резкое увеличение оптической плотности, что определяет температуру перехода при заданной концентрации. Обратимый характер перехода ELP подтверждается с помощью сканирования мутности при охлаждении. Кристаллические сополимеры ELP демонстрируют более сложный профиль мутности, чем гомополимерные ЛП.

Затем можно провести измерения динамического рассеяния света для подтверждения поведения этих ЛП, которое выводится из файла профиля мутности. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как очистить рекомбинантные эластиновые полипептиды из кишечной палочки с помощью обратного переходного цикла. Нет-нет-нет-нет-нет.