В естественных условиях клоновых Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников оцениваться пятью флуоресцентных белков с помощью конфокальной и многофотонной микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в отслеживании флуоресцентно меченых гемопоэтических клонов в живых тканях, включая костный мозг, с использованием новой стратегии конфокальной и двухфотонной микроскопии. Для этого гемопоэтический предшественник и стволовые клетки murn выделяют и совместно трансдуцируют с онтологией лентивирусного гена или векторами Lego, кодирующими пять флуоресцентных белков: Ian, EGFP, Venus, TD tomato, m cherry. Затем трансдуцированные клетки трансплантируются мышам-реципиентам с миелоабляцией, и через периоды времени до 120 дней у мышей-реципиентов собирают костный мозг и органы, а также проводят комбинированную конфокальную и двухфотонную микроскопию.

Полученные изображения реконструируются в 3D, чтобы отслеживать местоположение флуоресцентно помеченных трансплантированных клонов и клеток с течением времени. Это облегчает изучение клональной эволюции во время кроветворения и судьбы клеток, полученных из костного мозга в других органах. Основное преимущество этого метода перед физическим срезом тканей заключается в том, что он сочетает в себе преимущества визуализации высокого разрешения с оптическим срезом с помощью конфокальной микроскопии и визуализацией структурных компонентов с помощью двойной микроскопии.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гематологии, такие как специальный и временной клональный анализ кроветворения во время регенерации костного мозга от раннего приживления с географическим сопровождением расширяющихся клонов с течением времени, Могут быть исследованы очень большие объемы интактной плотной ткани. Например, около 3000 изображений были реконструированы с помощью вычислений для визуализации клонов, помеченных цветом, в грудине. Хотя этот метод может дать представление о клональной архитектуре при нормальном и возмущенном кроветворении, он также может быть применен для изучения регенерации органов, иммунных реакций или метастатических паттернов опухолей.

В этой процедуре онтология лентивирусных генов или векторы Lego кодируют пять флуоресцентных белков: Ian EGFP, Venus, TD tomato, и M Cherry. Каждый флуоресцентный белок экспрессируется сильным конститутивным вирусом, образующим селезеночный очаг, или промотором SFFV. После создания векторов Lego, кодирующих флуоресцентные белки и титрующих вирусные частицы, соберите костный мозг из передних и задних конечностей мышей-доноров, препарировав бедренные кости и большеберцовую кость.

С помощью скальпеля тщательно удалите все мышечные связки и лишнюю ткань из костей. Далее разрежьте поперек конца каждой кости как можно ближе к суставу. С помощью иглы 27 калибра на шприце, содержащем среду I 10, промойте костный мозг в 50-миллилитровую центрифугу с конической центрифугой при температуре 500 G и четырех градусах Цельсия для гранулирования клеток.

После удаления надосадочной жидкости для лизирования эритроцитов добавьте 50 миллилитров буферной центрифуги CK, как и раньше, затем выбросьте надосадочную жидкость и повторите после удаления второй надосадочной жидкости. Ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах I 10 среды. Затем используйте набор для максимального истощения линии для очистки клеток-предшественников в соответствии с протоколом модифицированного набора, подробно описанным в сопроводительном документе.

После того, как линейно-отрицательные клетки будут очищены, поместите их в колбу с температурой Т-75 с плотностью от пяти до 10-5 клеток на миллилитр в среде для стволового цикла, дополненной мышиным ИЛ трем мышиным ИЛом 11, человеческим FL, тремя лигандами и фактором мышиных стволовых клеток, инкубируют при 37 градусах Цельсия 5% CO2 в течение 48 часов. Через два дня используйте скребок для ресуспендирования клеток и перенесите от одной до четырех раз по 10 до пяти клеток в лунку из 12. В скважину добавляют векторы с MOI от шести до семи каждый в стволовую среду с цитокинами и четырьмя микрограммами на миллилитр сульфата протамина в клетки.

Чтобы довести общий объем в каждой лунке до одного миллилитра, обязательно подготовьте единый контроль цвета для каждого флуоресцентного белка. Через 24 часа повторно суспензируйте клетки с помощью скребка и переложите их в пятимиллилитровую центрифужную пробирку. Затем центрифугируют и ресуспендируют их в среду стволового слоя без цитокинов, снова центрифугируют и ресуспендируют клетки в 100 микролитрах стволовой среды без цитокинов за одну инъекцию или для конфокальной микроскопии или проточной цитометрии.

Переложите их в 12 луночных планшетов, содержащих свежую среду с цитокинами и культурой, еще на 96 часов. При подготовке к пересадке костного мозга поместите облученных мышей-реципиентов в клетку под согревающим светом, пока мыши согреваются. Подготовьте шприцы для инъекций от одного до четырех умножить на 10 до пятой линии отрицательных клеток в 100 микролитрах стволового размаха на одну мышь.

Приготовьте по одному шприцу для каждой мыши. Когда хвостовые вены расширены, мыши готовы к инъекции. Поместите мышь, которую нужно ввести, в удерживающее устройство для мыши и продезинфицируйте хвост с помощью подушечки, смоченной на 70% в этаноле.

Этот шаг также позволяет лучше визуализировать хвостовую вену. Затем вводят клетки в хвостовую вену. Пересадите целую когорту животных с одной и той же популяцией трансдуцированных донорских клеток костного мозга в разное время до 120 дней после трансплантации.

Извлекайте ткани и органы для неповрежденной визуализации без разрезания. Поместите отдельные органы в 35 миллиметровое число ноль. Накройте стеклянную посуду для культуры холодным PBS объемом от 50 до 100 микролитров для покадровой визуализации.

Поместите органы в DMEM 10% FBS, содержащую 20 миллимолярных куч при температуре 37 градусов Цельсия, и немедленно сделайте визуализацию. Здесь микроскопия выполняется с помощью инвертированной пятиканальной конфокальной и многофотонной системы Leica SP, оснащенной многолинейным аргоновым диодом на 561 нанометр, гелием, неоном на 594 нанометра и гелием, неоном на 633 нанометра видимыми лазерами. Поместите один из образцов из Lego на предметный столик и сфокусируйтесь.

Собирайте стеки лямбда-изображений с интервалом в пять нанометров, охватывающие весь световой спектр. Затем с помощью программного обеспечения выберите интересующую область на изображении и просмотрите гистограмму опорного спектра. Сохраните эти данные.

Затем повторите этот процесс для каждого флуоресцентного белка в эксперименте. Затем используйте спектры, собранные от отдельных флуоресцентных белков, чтобы задать ширину полосы пропускания в режиме канала. Чтобы сделать это для каждого канала, нажмите на черный ползунок и введите используемую пропускную способность.

Выбранная ширина полосы должна охватывать пиковую область спектра возбуждения каждого флуоресцентного белка, обеспечивая при этом отсутствие перекрытия между флуоресцентными каналами. Установите усиление и смещение для каждого детектора таким образом, чтобы динамический диапазон выходного образца находился на обнаруживаемом уровне, аналогичном между флуоресцентными белками и без насыщения. Например, белок вишни M примерно в два раза ярче, чем EGFP, поэтому усиление и смещение должны быть отрегулированы, чтобы дать одинаковый динамический диапазон для обоих.

Наконец, в режиме канала захватите изображение каждого отдельного контрольного образца цвета со всеми пятью каналами и убедитесь, что каждый флуоресцентный белок виден только в соответствующем канале и отсутствует в остальных. После того, как спектры для всех каналов будут проверены, сохраните настройки. Они могут быть импортированы и использованы в будущих экспериментах, в которых используются те же флуоресцентные белки и образцы ткани.

Здесь показана комбинированная конфокальная и двухфотонная микроскопия с использованием костного мозга грудины с использованием скальпеля и пинцета по разрезу грудины по сагиттальной плоскости. Затем сделайте поперечный разрез по суставу между двумя грудными ямками. Поместите срезанные кости лицевой стороной вниз в 35-миллиметровую чашку с нулевым покровным стеклом, содержащую от 50 до 100 микролитров холодного PBS, визуализация будет проходить через разрезанную поверхность.

Проверьте положение костей в рассекающем микроскопе. Расположите образец на предметном столике микроскопа. Затем настройте программное обеспечение для обработки изображений на последовательный захват двух фотонов с сигналом, генерируемым второй гармоникой.

Затем пятицветное конфокальное возбуждение. Задайте границы области сбора Зака с шагом в пять микрон от 150 до 300 микрон. Используйте функцию плитки, чтобы дать команду программному обеспечению автоматически генерировать сшитые объемы, составляющие всю грудную ямку размером примерно 2,5 на 1,2 квадратных миллиметра в направлении XY.

Инициируйте захват для последовательного сбора изображений X, Y, Z во всех пяти каналах, а также двухфотонной микроскопии с сигналом, генерируемым второй гармоникой от кости и фибриллярного коллагена, для четырехмерной покадровой визуализации. Поместите свежеиссеченные, неразрезанные образцы подколенных лимфатических узлов, селезенки, легких или костей на 35-миллиметровое число ноль. Накрывайте стеклянную культуральную посуду от 50 до 100 микролитров DMEM с 10% FBS и 20 миллимолярными кучами при 37 градусах Цельсия.

Поместите образец на нагретый предметный столик микроскопа. Затем в программном обеспечении переключаются параметры захвата, чтобы использовать двухфотонное возбуждение титан-сапфиром на частоте 860 нанометров в сочетании с конфокальным возбуждением и резонансным сканером Leica на частоте 8000 герц в секунду. Взяв стеки 80 микрон Z с 22-м интервалом в течение одного часа для одновременной трехцветной двухфотонной визуализации, программное обеспечение должно использовать титановый сапфир, настроенный на 860 нанометров, одновременно с лазером OPO, настроенным на 1,130 нанометра для томата TD или 1,140 нанометра для вишни M.

Наконец, запустите захват, чтобы собрать четыре D-изображения. Как и раньше, после того, как все изображения будут собраны, выполните 3D- и четырехмерную реконструкцию и анализ с использованием 64-разрядной версии Amer или аналогичного программного обеспечения в программном обеспечении. Откройте изображение Зака, выберите «Превзойти», чтобы отобразить 3D объемный визуализатор.

Затем с помощью функции «Навигация» поверните громкость на 360 градусов. Далее выбираем анимацию. Используйте ключевые кадры для добавления выбранных видов, масштабирования и поворотов объема.

Просмотрите фильм и отредактируйте его по мере необходимости. Наконец, сохраните файл в нужном формате фильма, чтобы проследить клональную историю флуоресцентно меченных гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников. Донорские клетки, трансдуцированные пятью различными векторами Lego, были пересажены мыши-реципиенту, а костный мозг грудины был визуализирован и проанализирован, как описано в этом видео.

Через четыре дня после трансплантации кластеры клеток, помеченных самыми разными цветами, были видны в непосредственной близости от края кости, который показан белым цветом. К 31-му дню большой клон уникального зелено-желтого цвета расширился и занял весь Фосс, как показано на объединенных и одноканальных изображениях. Контент-анализ FPS показал однородную маркировку по двум дисперсиям FPS: EGFP и Венере.

Это видео 3D-реконструкции демонстрирует пространственную архитектуру помеченных клонов, заключенных в грудную кость. На этом изображении показан пример клеток, полученных из костного мозга, в подколенном лимфатическом узле через 120 дней после трансплантации. Рассеянные клетки в основном отмечены желтым и красным цветом и по периферии окружены коллагеновыми волокнами, показанными белым цветом в сердце, если смотреть с эпикардиальной стороны.

Видны многочисленные отдельные клетки, перемежающиеся между кардиомиоцитами, показанными белым цветом, визуализированными их двухфотонной автофлуоресценцией на 780 нанометрах после освоения. Эту методику можно сделать за несколько дней, если ее правильно выполнить после ее освоения. Этот метод проложил путь исследователям в области регенерации и развития органов, а также в области биологии для изучения пространственно-временного расположения клонально сложных клеточных и структурных элементов с помощью многоцветной маркировки, конфокальной и двухфотонной визуализации.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как разработать методологию флуоресцентной маркировки для отслеживания клональной маркировки гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток в живых органах.