Генерация и очистка человека INO80 хроматина комплексов и подкомплексов

Целью данной процедуры является получение и очистка белков дикого типа и мутантных версий многобелкового комплекса ремоделирования хроматина NuRD. Это достигается путем первоначального выделения ядер из клеток, экспрессирующих белки NuRD с FLAG-эпитопной меткой. На втором этапе готовят ядерные экстракты, после чего комплексы ремоделирования хроматина NuRD человека дикого типа или мутантные формы очищают с помощью аффинной хроматографии с использованием антител Anti-Flag. В конечном итоге состав субъединиц очищенных комплексов NuRD может быть проанализирован с помощью вестерн-блоттинга или окрашивания серебром.

Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы о том, как субъединицы многобелковых комплексов ремоделирования хроматина влияют на их общую активность. Метод разработан специально для изучения дикого типа и мутантных версий комплекса ремоделирования хроматина NO 80, однако он также может быть использован для изучения других многобелковых ядерных комплексов, таких как медиатор.

Наиболее критическим этапом процедуры является экстракция ядер. Обычно возникают сложности из-за того, что в ходе солевой экстракции соль добавляют слишком быстро или слишком интенсивно. После культивирования в роллерах перенесите клетки HEC 2 9 3 в мерный конический центрифужный флакон подходящего размера и центрифугируйте их в течение 10 минут при 1000 ×g и 4 °C. После удаления супернатанта измерьте объем осажденного клеточного осадка, затем ресуспендируйте осадок в пяти объемах буфера А (относительно объема осадка), аккуратно используя пипетку, и инкубируйте клетки на льду ровно 10 минут.

После повторного центрифугирования клеток снова измерьте объем клеточного осадка; он должен увеличиться примерно в два раза. На этот раз суспендируйте клетки в объеме буфера A, равном двум объемам упакованных клеток, затем перенесите клеточную суспензию в подходящий по размеру гомогенизатор для тканей и гомогенизируйте ее с помощью свободного стеклянного пестика до тех пор, пока 90% клеток не окрасятся трипановым синим. Центрифугируйте гомогенизированные клетки в высокоскоростной центрифужной пробирке объемом 45 мл в течение 20 минут при 25 000 ×g и 4 °C в роторе с фиксированным углом. Затем удалите супернатант, содержащий цитозольные белки, из ядерного осадка, чтобы экстрагировать ядра с помощью соли.

Теперь добавьте 2,5 миллилитров буфера C на каждые три миллилитра исходного объема плотного осадка клеток. Затем с помощью серологической пипетки отделите осадок от стенки пробирки и перенесите всю смесь в гомогенизатор подходящего размера. Гомогенизируйте смесь двумя движениями пестика, чтобы ресуспендировать ядра, а затем перенесите ресуспендированную ядерную фракцию в охлажденный стакан такого размера, чтобы глубина суспензии в нем составляла не менее 0,5 сантиметра.

Затем, согласно следующей формуле, рассчитайте объем 5 M раствора хлорида натрия, необходимый для достижения конечной концентрации 0,42 M хлорида натрия в растворе. Постепенно добавляйте рассчитанный объем солевого раствора по каплям, осторожно перемешивая суспензию стеклянной палочкой на льду, для повышения концентрации соли в суспензии до тех пор, пока весь хлорид натрия не будет добавлен и раствор не станет очень вязким. Затем аккуратно перенесите вязкую суспензию в поликарбонатные пробирки объемом 70 мл в ротор TI 45 с системой крышек и с помощью миксера медленно перемешивайте запечатанные пробирки при 4 °C. Через 30 минут центрифугируйте образцы в роторе TI 45 в течение 30 минут при 40 000 ×g и 4 °C, после чего соберите супернатанты, содержащие ядерный экстракт, в один пластиковый контейнер.

Затем разделите раствор ядерного экстракта на аликвоты подходящего размера, быстро заморозьте их в жидком азоте и храните при температуре −80 °C. Для подготовки Anti-Flag aros для иммуноочистки сначала используйте 200-микролитровую пипетку с обрезанным наконечником, чтобы перенести 200 µL 50%-ной суспензии гранул Anti-Flag aros в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Перенесите предварительно промытые гранулы в коническую пробирку, содержащую 10 мл свежеразмороженного ядерного экстракта, и инкубируйте в течение 4 часов при 4 °C при медленном вращении на лабораторном ротаторе, после чего соберите flag aros путем центрифугирования в течение 5 минут при 1000 ×g и 4 °C.

Затем промойте экстракт бусин P в 10 миллилитрах буфера LyS 450 в течение пяти минут при температуре 4 °C, осторожно встряхивая на ротаторе. После центрифугирования смеси экстракта бусин повторите процедуру. Ресуспендируйте осадок в 100–150 µL свежего буфера LyS 450 и перенесите бусины в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Продолжайте промывать коническую пробирку объемом 15 мл 100–150 мкл Lysol 50 до тех пор, пока все гранулы не будут перенесены в микроцентрифужную пробирку. После центрифугирования гранул в микроцентрифуге промойте их трижды 1 мл Lysol 50 и один раз 1 мл буфера EB 100. Затем, чтобы элюировать связавшиеся белки, добавьте 200 мкл буфера EB 100, содержащего Flag-пептид, и инкубируйте образец при температуре 4 °C на льду.

Через полчаса осадите гранулы в микроцентрифуге, затем перенесите супернатант, содержащий элюированный комплекс OAC C, в новую микроцентрифужную пробирку. После повторения элюции еще четыре раза пропустите полученный элюат через пустой спин-колонку, чтобы удалить остаточные флаг-аэрогранулы из белковой фракции. Наконец, используйте устройство для центрифужного ультрафильтрирования с порогом отсечения по молекулярной массе 50 000 Да, чтобы сконцентрировать элюированную белковую фракцию примерно в 10 раз.

Как показано на этом рисунке, чистота комплексов NO 80, приготовленных с использованием указанных субъединиц с flag-тегом, как было продемонстрировано ранее, может быть оценена с помощью SDS-полиакриламидных гелей с окрашиванием серебром. Любые белки, появляющиеся в этой контрольной дорожке, являются примесями, которые неспецифически связываются с flag-агарозой. Эти метки указывают на полосы, соответствующие протестированным субъединицам NO 80, а эти — на подвижность маркеров молекулярной массы.

Положение дикого типа NO 80 отмечено черным квадратом, а положения мутантов NO 80 — незакрашенными кругами. Дорожки, разделенные черной линией, относятся к разным гелям. Состав комплексов можно оценить с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител к различным субъединицам NO 80.

Например, здесь были оценены субъединицы модуля концевого терминального домена, модуля, связанного с центром хеликазы, и модуля SNF2. После освоения эта методика может быть выполнена в течение одного дня, начиная со сбора клеток и заканчивая очисткой комплексов.

Данный метод позволит исследователям очищать многобелковые комплексы и субкомплексы клеток млекопитающих для изучения их функций. После просмотра этого видео вы получите более четкое представление о том, как очищать комплексы ремоделирования хроматина и другие многобелковые комплексы из линий клеток человека или других линий клеток млекопитающих.