Генерация и очистка человека INO80 хроматина комплексов и подкомплексов

Целью данной процедуры является создание и очистка диких типов и мутантных версий мультисубъединицы в комплексе ремоделирования oh 80 хроматина. Это достигается путем выделения ядер из клеток, экспрессирующих эпитоп флага, меченный белками O 80 На втором этапе получают ядерные экстракты, а затем дикий тип или мутантный человек в комплексах ремоделирования хроматина O 80 очищают с помощью хроматографии Anti-Flag aros. В конечном счете, субъединичные составы очищенных комплексов NO 80 могут быть проанализированы методом вестерн-блоттинга или окрашивания серебром.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как субъединицы комплексов ремоделирования хроматина MultiPro участвуют в их общей активности. Этот метод разработан специально для изучения дикого типа и мутантных версий комплекса ремоделирования хроматина NO 80, но он также может быть использован для изучения других многосубъединичных ядерных комплексов. Как и медиатор.

Наиболее важным этапом процедуры является этап извлечения ядра. Люди обычно сталкиваются с проблемами, потому что на этапе экстракции соли люди склонны добавлять соль слишком быстро или слишком энергично После культивирования в роликовых бутылках перенесите элементы HEC 2 9 3 в коническую трубку подходящего размера и вращайте их в течение 10 минут при температуре 1000 G и четырех градусах Цельсия. После удаления супината измерьте объем упакованной клеточной гранулы, затем повторно суспендируйте гранулу в пяти пакетных объемах буфера А с помощью щадящего пипетирования и инкубируйте клетки на льду ровно в течение 10 минут.

После повторного вращения ячеек измерьте клеточную гранулу второй раз, она должна увеличиться в размерах до двух раз. На этот раз повторно суспендируйте клетки в двух пакетных объемах буфера А, затем перенесите клеточную суспензию в гомогенизатор пуха соответствующего размера и гомогенизируйте клеточную суспензию с помощью сыпучего стеклянного пестика до тех пор, пока 90% клеток не окрасятся положительно с помощью центрифуги Trian Blue, гомогенизированные клетки в 45-миллилитровой высокоскоростной центрифужной пробирке в течение 20 минут при 25 минутах. 000 000 G и четыре градуса Цельсия в роторе с фиксированным углом. Затем удалите натант SUP, содержащий цитозольные белки, из ядерной гранулы, чтобы извлечь ядра с солью.

Теперь добавьте в гранулу 2,5 миллилитра буфера С, но каждые три миллилитра от исходного объема упакованной ячейки. Затем с помощью серологической пипетки выбить гранулу со стенки пробирки и перенести всю смесь в пуховый гомогенизатор соответствующего размера. Гомогенизируйте смесь двумя взмахами рассыпного пестика, чтобы ресуспендировать ядра, а затем переложите ресуспендированную ядерную фракцию в охлажденный стакан такого размера, чтобы суспензия заполнила стакан по крайней мере на 0,5 сантиметра в глубину.

Далее рассчитайте объем пяти моляров хлорида натрия, необходимый для доведения раствора до конечной концентрации 0,42 моляра хлорида натрия по следующей формуле. Теперь постепенно добавляйте рассчитанный объем раствора соли капля за каплей, аккуратно взбивая суспензию стеклянным стержнем по льду, чтобы увеличить концентрацию соли в суспензии до тех пор, пока не будет добавлен весь хлорид натрия и раствор не станет очень вязким. Затем осторожно переложите вязкую суспензию в 70-миллилитровые поликарбонатные пробирки в ротор типа 45 TI с крышкой в сборе и с помощью мутатора медленно раскачивайте герметичные пробирки при температуре четыре градуса Цельсия Через 30 минут ультрацентрифугируйте образцы в роторе TI 45 в течение 30 минут при 40 000 перегрузках и четырех градусах Цельсия. и вытащить ядерный экстракт, содержащий надосадочную жидкость, в один пластиковый контейнер.

Затем разделите раствор ядерного экстракта на аликвоты удобного размера, заморозьте их в жидком азоте и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия. Чтобы приготовить Anti-Flag aros для иммуноочистки, начните с использования пипетки объемом 200 микролитров с отрезанным наконечником для переноса 200 микролитров суспензии из гранул Anti-Flag aros 50% в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Переложите предварительно промытые шарики в коническую пробирку, содержащую 10 миллилитров только что размороженного ядерного экстракта, до четырех часов по Цельсию с медленным вращением на лабораторном ротаторе, а затем соберите флажк с помощью центрифугирования в течение пяти минут при температуре 1000 G и четырех градусах Цельсия.

Далее промойте каплю экстракта Р в 10 миллилитрах от вшей, четыре 50 буфером в течение пяти минут четырех градусов Цельсия с легким покачиванием на мутаторе. Затем, после раскручивания смеси экстракта в гранулах, еще раз используйте повторно. Суспензируйте гранулу в 100 – 150 микролитрах свежих вшей четырех 50, переложите шарики в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров

Продолжая промывать коническую пробирку объемом 15 миллилитров от 100 до 150 микролитров Lysol 50, пока все шарики не будут перенесены в микроцентрифужную пробирку. После раскручивания шариков в микроцентрифуге промойте их три раза одним миллилитром lys four 50 и один раз одним миллилитром EB 100.Buffer. Затем для элюирования связанных белков добавьте 200 микролитров буфера EB 100, содержащего пептид флага, и инкубируйте образец при температуре четыре градуса Цельсия на орехе.

Через полчаса гранулируйте шарики в микроцентрифуге, которую вы наберете, а затем перенесите натант SUP, содержащий элюированный в OAC C комплекс, в свежую микроцентрифугу. Повторив элуциан еще четыре раза, пропустите вытянутый элюат через пустую спиновую колонку, чтобы удалить остатки аэробусин из белковой фракции. Наконец, используйте центробежное устройство ультрафильтрации с отсечкой 50 000 молекулярной массы для концентрации указанной белковой фракции примерно в 10 раз.

Как показано на рисунке, чистоту комплексов NO 80, приготовленных с использованием указанных субъединиц маркировочных меток, как показано выше, можно оценить с помощью окрашенных серебром полиакриламидных гелей SDS. Любые белки, которые появляются на этой контрольной полосе, являются загрязнителями, которые неспецифически связываются с флагами. Эти метки указывают на запреты, соответствующие тестируемым субъединицам NO 80, а также на подвижность маркеров молекулярной массы.

Положение дикого типа NO 80 обозначено черным квадратом, а положение мутантов NO 80 обозначено открытыми кругами. Дорожки, разделенные черной линией, относятся к отдельным гелям. Состав комплексов можно оценить по Вестерну Блотту с использованием антител против различных субъединиц NO 80.

Например. Ниже приведены субъединицы модуля конечного терминального домена, ассоциированного модуля центра Helicase и модуля SNF two. Освоив эту технику, она может быть закончена в течение одного дня, начиная с забора клеток и заканчивая очищением комплексов.

Этот метод позволит исследователям очищать мультисубъединичные комплексы и субкомплексы для клеток млекопитающих, чтобы изучить их функции. После просмотра этого видео вы будете лучше понимать, как очистить ремоделирование хроматина и другие белковые комплексы с несколькими субъединицами из клеток человека или других импульсных клеточных линий.