Биохимические анализы для анализа деятельности АТФ-зависимых ферментов хроматина

Целью следующей процедуры является измерение различных биохимических активностей ТР-зависимых комплексов ремоделирования хроматина. Это достигается путем измерения ТР-зависимого сдвига позиционированной нуклеосомы от одного конца молекулы ДНК к более центральному положению на ДНК с помощью анализа сдвига электрофоретической подвижности или EMSA. Аналогичный метод на основе EMSA может быть использован для мониторинга образования связанных с ремоделирующим комплексом мононуклеосом с целью оценки активности связывания нуклеосом комплексами ремоделирования хроматина.

Кроме того, для измерения активности АФА ТР-зависимых комплексов ремоделирования хроматина можно использовать тонкослойную хроматографию. В конечном итоге эти методы могут быть применены для измерения ТР-зависимого ремоделирования хроматина в человеческих комплексах O 80. В этом видео мы продемонстрируем биохимические анализы по изучению комплексов ремоделирования хроматина NO 80.

Аналогичный метод может быть применен и для изучения других комплексов ремоделирования хроматина. Для проведения анализа нуклеосомного ремоделирования, зависимого от TP, сначала подготовьте нуклеосомные субстраты, настроив ПЦР-реакцию объемом 100 µL, как указано в таблице. Проведите ПЦР-реакции в термоциклере, после чего дважды пропустите продукты реакции через спин-колонки, очищенные от нуклеаз, чтобы удалить все неиспользованные нуклеотиды.

Затем смешайте два пмоль фрагментов ДНК 6 0 1, меченных P 32, с шестью микрограммами нуклеосом hilar в 50 мкл буфера и инкубируйте смесь при 30 °C в течение 30 минут. Затем последовательно разбавьте смесь до 0,8 М, 0,6 М и 0,4 М хлорида натрия путем добавления 12,5 мкл, 20,8 мкл и 41,6 мкл соответственно раствора трис-HCl буфера с добавлением E-D-T-A-P-M-S-F и DTT; после каждого добавления инкубируйте в течение 30 минут при 30 °C. После последней инкубации добавьте 125, а затем 250 мкл трис-гидрохлоридного буфера. Далее, с дополнительным добавлением non indebt P 40 глицерина и PSA, проведите еще два 30-минутных разбавления при 30 °C до 0,2 М и 0,1 М хлорида натрия соответственно.

Затем храните субстрат из мононуклеосом при температуре four degrees Celsius до трех месяцев перед проведением анализов с использованием нативных полиакриламидных гелей. Для каждой отдельной реакции смешайте около 20 nanomolar NO 80 с соответствующим количеством буфера EB 100, достаточным для получения общего объема 4.75 µL, в предварительно охлажденной силиконизированной микроцентрифужной пробирке объемом 1.5 mL. Остатки фракций, содержащих NO 80, следует немедленно заморозить в измельченном сухом льду.

Затем внесите 5,25 µL свежеприготовленного мастер-коктейля в каждую реакционную пробирку, тщательно перемешивая путем пипетирования вверх-вниз. После этого инкубируйте реакционные смеси в термоблоке при температуре 30 °C. По окончании инкубации добавьте в каждую пробирку 1,5 µL свежеприготовленной смеси для остановки реакции, затем перемешайте содержимое каждой пробирки.

Центрифугируйте образцы и инкубируйте их при 30 °C еще в течение 30 минут. Тем временем проведите предварительный электрофорез нативного полиакриламидного геля в вертикальной электрофоретической камере при напряжении 100 В в течение 30 минут при 4 °C, используя 0,5 XTBE в качестве бегающего буфера; для поддержания постоянной циркуляции буфера в нижней камере используйте магнитный перемешиватель. По окончании инкубации снимите осадок и к каждой реакционной смеси добавьте по 2,5 µL красителя для нанесения. После кратковременного центрифугирования нанесите образцы на гель с помощью наконечников для нанесения.

Проводите электрофорез в геле при 200 вольтах в течение 4,5 часов при температуре четырех градусов Цельсия с циркуляцией буфера. Затем перенесите гель на стопку из двух листов фильтровальной бумаги и плотно оберните фильтры с гелем сверху прозрачной пластиковой пленкой для регистрации сигнала. Экспонируйте гель на фосфоресцентный экран для хранения при четырех градусах Цельсия в течение необходимого времени, после чего отсканируйте экран с помощью системы изотопного имиджинга и проанализируйте данные с использованием соответствующего программного обеспечения для проведения анализов APA в зависимости от ДНК и нуклеосом.

Начните с объединения от 10 до 50 нМ иммуноочищенных субкомплексов с количеством буфера eeb 100, достаточным для получения объема 2,2 µL, в предварительно охлажденной смазанной микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл для каждой реакции, после чего немедленно заморозьте все фракции, содержащие NO 80, в порошковом сухом льду. Затем осторожно смешайте 2,8 µL свежеприготовленного субкоктейля, содержащего ДНК-нуклеосомы или не содержащего их, с реакционными пробирками, содержащими фермент, путем пипетирования вверх-вниз и перенесите пробирки в термоблок при температуре 30 °C. Далее с помощью карандаша проведите очень слабую линию на расстоянии не менее 1,5 см от нижнего края полиэтилена размером 20 на 10.

Имеется в виду тонкослойная хроматография или ТСХ-пластинка. Затем нанесите по 0,5 µL каждой реакционной смеси на линию через 5, 15, 30 и 60 минут после инкубации, немедленно возвращая каждый образец в термоблок, чтобы можно было отобрать пробы в нескольких временных точках из одной пробирки. После нанесения последнего образца высушите пластинку с помощью фена, а затем перенесите её в стеклянную камеру, содержащую достаточное количество.

0,375 М калия фосфата, чтобы нижние 0,5 сантиметров пластины ТСХ были погружены в раствор. Закройте камеру и проводите разделение до тех пор, пока фронт жидкой фазы не достигнет верхнего края пластины ТСХ; после этого пластину следует немедленно высушить с помощью струи воздуха и экспонировать на фосфоресцентный экран при комнатной температуре. В завершение просканируйте экран с помощью системы изотопного имидж-сканера, чтобы определить количество радиоактивного субстрата αTP и продукта αDP.

Этот первый эксперимент демонстрирует, что комплекс, очищенный через flag IES two flag, N-O-A-T-E и flag NO 80 delta N, обладает схожей активностью по сдвигу нуклеосом, что указывает на то, что N-конец NO 80 и/или его ассоциированные субъединицы не являются необходимыми для ремоделирования нуклеосом комплексом NO 80. Напротив, комплекс, очищенный через flag NO 80 delta n delta HSA, неактивен в данном анализе, что свидетельствует о зависимости активности ремоделирования от HSA-домена NO 80 APAs и/или его ассоциированных субъединиц. Используя модификацию методики анализа сдвига нуклеосом, можно измерить активность связывания нуклеосом комплексами ремоделирования хроматина.

В данном эксперименте инкубация нуклеосом с возрастающими количествами интактных комплексов NO 80, очищенных с помощью субъединицы NO 80 E, привела к дозозависимому исчезновению полосы, соответствующей свободным мононуклеосомам, и появлению нового смещенного вида, который мигрировал почти у верхней границы геля. Напротив, при инкубации нуклеосом с более мелкими комплексами, которые были очищены с помощью NO 80 delta N и в которых отсутствовал определенный набор субъединиц NO 80, смещенный вид мигрировал быстрее; это позволяет предположить, что относительная подвижность суперсмещенной полосы определяется размером анализируемых комплексов. В этом заключительном эксперименте представлены результаты анализа, сравнивающего активность APA, активируемую ДНК и нуклеосомами, для двух различных субкомплексов NO 80.

Пятна с более медленной миграцией соответствуют исходному $\alpha\text{ }^{32}\text{P}$-меченому $\text{a TP}$, а виды с более быстрой миграцией представляют собой продукты реакции $\text{A DP}$; стрелки указывают направление миграции растворителя. При использовании данных процедур важно помнить о необходимости проведения анализов с различной продолжительностью и разными концентрациями фермента. Это позволит гарантировать, что измерения проводятся в области линейности кривых зависимости выхода продукта от времени и дозозависимости.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как анализировать активность связывания нуклеосом и активность скольжения нуклеосом очищенных комплексов ремоделирования хроматина с помощью TPA. Не забывайте, что работа с радиоактивными материалами может быть опасной. Необходимо соблюдать меры предосторожности, такие как ношение лабораторного халата и средств защиты глаз, контроль радиоактивного загрязнения и надлежащая утилизация радиоактивных отходов.